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ARMD出血患者血清miR-27a和NRF2的表达与预后的相关性

2021-06-03 196 上传者：管理员

摘要：目的:检测年龄相关性黄斑变性(ARMD)出血患者血清微小RNA-27a(miR-27a)和转录因子E2相关因子(NRF2)的表达情况，并研究其相对表达量与ARMD出血患者预后的相关性。方法:采用回顾性病例对照研究，收集2018-06/2019-10在本院眼科确诊并治疗的ARMD出血患者80例为ARMD出血组，选取同期在本院进行常规检查的健康受试者80例为对照组。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测所有研究对象血清miR-27a和NRF2相对表达量；通过研究对象工作特征曲线(ROC)评估血清miR-27a和NRF2相对表达量对ARMD出血的诊断价值；分析患者预后不良情况发生率；采用Logistic回归分析ARMD出血患者预后不良的影响因素。结果:ARMD出血患者血清miR-27a相对表达量显著高于对照组(P<0.01),血清NRF2mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.01)。ROC结果显示，血清miR-27a和NRF2诊断ARMD出血的AUC分别为0.867、0.820,截断值分别为1.10、1.08,此时对应灵敏度分别为71.3%、91.3%,特异性分别为90.0%、63.7%。血清miR-27a和NRF2联合检测ARMD出血的AUC为0.912,此时对应灵敏度和特异性分别为86.3%、85.0%。高miR-27a组患者预后不良发生率明显高于低miR-27a组(P<0.05);高NRF2组患者预后不良发生率显著低于低NRF2组(P<0.05)。Logistic分析显示，血清miR-27a高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的危险因素，血清NRF2高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的保护因素。结论:miR-27a在ARMD出血患者血清中的相对表达量明显升高，NRF2相对表达量明显降低，两者对ARMD出血具有一定诊断价值，且其表达情况与患者预后密切相关，提示血清miR-27a和NRF2可作为ARMD出血的早期诊断及预后评估的潜在生物学指标。

关键词：
年龄相关性黄斑变性
微小RNA-27a
视网膜组织退行性病变
转录因子E2相关因子
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引言

年龄相关性黄斑变性又称老年性黄斑变性(ARMD),是一种黄斑区视网膜组织退行性病变，是目前老年人视力损害和致盲的主要原因，根据病理类型分为干性ARMD和湿性ARMD,湿性ARMD的病理变化是脉络膜新生血管(CNV)形成，常伴有出血现象发生[1]。ARMD出血可引起患者中心视力下降，严重者可致盲[2]。目前临床上主要通过玻璃体内注射抗血管内皮因子治疗湿性ARMD,但无法有效治愈[3]。因此，探讨ARMD,尤其是ARMD合并出血的发病机制对患者的早期诊断、治疗及预后评估具有重要的意义。微小RNA-27a(microRNA-27a,miR-27a)是一种广泛存在于生物体内的非编码单链小分子RNA[4],研究表明miR-27a在调节机体各平衡中发挥重要作用[5]。转录因子E2相关因子(nuclearfactorerythroid-2-relatedfactor2,NRF2)是存在于细胞内的一种重要的转录因子，具有抗氧化反应、抗炎、神经保护、抗凋亡等多种作用[6]。然而miR-27a和NRF2在ARMD出血患者中的表达及与预后的关系不完全清楚。鉴于此，本研究拟通过检测ARMD出血患者血清miR-27a和NRF2的表达情况，并探究其表达水平与ARMD出血患者临床预后的关系，以期为临床早期诊断及治疗ARMD出血提供有价值的参考依据，现报告如下。

1、对象和方法

1.1对象

采用回顾性病例对照研究，收集2018-06/2019-10在本院眼科确诊并治疗的ARMD出血患者80例为ARMD出血组，纳入标准：(1)符合《实用眼科学》中制定的有关ARMD的相关诊断标准[7],伴有出血现象发生者；(2)年龄大于45岁；(3)患者选择在本院接受治疗者；(4)临床资料齐全者。排除标准[8]:(1)高度近视、眼部活动性炎症；(2)严重白内障，对患者视力产生严重影响；(3)黄斑前膜、黄斑裂孔、视网膜血管闭塞或中心性浆液性脉络膜视网膜病变；(4)近期确诊的感染、高血压、糖尿病、高血脂、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病等器质性病变；(5)临床随访资料不全者。同期选取在本院进行常规检查的健康受试者80例为对照组，纳入标准：(1)年龄大于45岁；(2)经体格检查体健，无心肝肾肺疾病、无风湿免疫系统疾病。排除标准：(1)有ARMD病史；(2)高度近视、眼部活动性炎症；(3)严重白内障，对患者视力产生严重影响；(4)黄斑前膜、黄斑裂孔、视网膜血管闭塞或中心性浆液性脉络膜视网膜病变；(5)近期确诊的感染、高血压、糖尿病、高血脂、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病等器质性病变。本研究经本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情并签署同意书，且符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器

离心机(货号：wi82487),购自于北京若水合科技有限公司；RNA提取试剂盒(货号：ml284600),购自于上海酶联生物公司；逆转录试剂盒(货号：KL266),购自于上海康朗生物科技有限公司；qRT-PCR试剂盒(货号：RR820A),购于北京宝日医生物技术有限公司；实时荧光定量PCR仪(型号：StepOneTM),购于美国应用生物系统公司；血清miR-27a和NRF2以及内参U6、GAPDH引物，由北京甘棠飞华生物科技有限公司合成；本研究中其他化学药品均购自上海锐塞生物技术有限公司。

1.2.2样品采集及保存

于清晨抽取所有受试者空腹状况下的静脉血5mL,离心后收集上层血清，置于-20℃冰箱中保存待测。

1.2.3血清miR-27a和NRF2的相对表达量

采用实时荧光定量PCR法(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)检测血清miR-27a和NRF2mRNA的相对表达量。具体操作步骤为：取待测血清，使用RNA提取试剂盒提取总RNA,然后经逆转录得到cDNA。以逆转录合成的cDNA为模板，进行qRT-PCR检测。PCR反应体系共10μL,上下游引物各0.2μL。PCR反应条件为：94℃,2min;94℃,30s;60℃,30s;74℃,35s,共40个循环。血清miR-27a和NRF2及内参U6、GAPDH的上下游引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法计算血清miR-27a和NRF2mRNA相对表达量，每个反应重复3次取平均值。

1.2.4随访及预后评估

对本研究中涉及到的所有患者治疗出院后进行门诊复查或电话随访，并根据相关标准对患者预后进行评估，随访时间为3mo,末次随访时间截止2020-01,以患者出现预后不良作为随访截止期，本次随访的中位随访时间为1.54mo,且本研究中未出现失访情况。

表1引物序列

预后评定：患者经治疗后视力无退化或好转为预后良好；患者治疗后视力持续退化为预后不良。

统计学分析：采用SPSS22.0进行统计学分析，计数资料用n(%)表示，组间比较采用卡方检验，计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验。采用研究对象工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristic,ROC)评估血清miR-27a和NRF2水平对ARMD出血的诊断价值。对ARMD出血患者发生不良预后的相关影响因素采用Logistic回归分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

ARMD出血组中男46例46眼，女34例34眼，年龄48～63(平均54.31±2.04)岁，体质量指数(bodymassindex,BMI)为21.83～22.49kg/m2。同期选取在本院进行常规检查的健康人群80例为对照组，其中男44例，女36例，年龄49～65(平均55.07±2.11)岁，BMI为21.71～22.37kg/m2。两组受试者性别、年龄、BMI等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.1两组受试者血清miR-27a和NRF2相对表达量的比较

ARMD出血组血清miR-27a的相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01),血清NRF2mRNA相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

2.2血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值

血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值见表3和图1。

2.3血清miR-27a和NRF2表达与ARMD出血患者预后的关系

分别以血清miR-27a和NRF2的截断值将ARMD出血患者分为高表达组和低表达组，其中高miR-27a组45例，低miR-27a组35例；高NRF2组37例，低NRF2组43例。高miR-27a组患者预后不良发生率明显高于低miR-27a组，差异有统计学意义(P<0.05);高NRF2组患者预后不良发生率显著低于低NRF2组，差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

2.4影响ARMD出血患者预后的因素分析

以ARMD出血患者预后不良是否发生为因变量(0=否，1=是),血清miR-27a和NRF2表达水平为自变量，采用逐步向前法，经Logistic回归分析，结果显示：血清miR-27a高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的危险因素(P<0.05),血清NRF2高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的保护因素(P<0.05),见表5。

3、讨论

ARMD是临床上常见的一种眼部疾病，属于致盲性退行性眼底病变[9]。ARMD出血是ARMD较为严重的一种，目前该疾病已成为老年人视力低下及致盲的主要原因[11]。流行病学研究显示，近年来随着中国人口老龄化程度的加深，患ARMD出血的患者呈逐年上升趋势，严重影响患者的健康及生活质量。然而，目前临床治疗ARMD出血的方法仍不完全有效，ARMD出血的早期诊断及治疗仍是医学者关注的热点。因此，寻找与ARMD出血相关的标志物，并探究其早期诊断及患者预后的相关性具有重要的临床意义[12]。

图1血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值。

表2两组受试者血清miR-27a和NRF2相对表达量的比较

目前已发现miRNA调节多种细胞功能并参与多种细胞通路，而视网膜细胞功能紊乱是导致ARMD疾病进展的关键因素。近期研究表明，miRNA如miR-17、miR-21、miR-27、miR-132、miR-204、miR-210、miR-296、miR-378、miR-519c和miR-15/107等均与ARMD的病程进展相关[13,14]。眼内miRNA的变化可能同时合并有血液中miRNA表达量的差异。因此研究外周血中miRNA在ARMD患者中表达量的差异对于发现ARMD的无创生物学标记物具有重要意义。miR-27a是miR-23a/27a/24-2簇家族的重要成员之一，位于第19号染色体上[15]。相关研究已证明，miR-27a与多种疾病的发生发展有关[16]。李宁宁等[17]研究发现，miR-27a在原发性痛风性关节炎患者中表达水平降低，其可作为炎症负性调控因子。朱美江等[18]研究发现miR-27a-3p在湿性ARMD患者外周血中表达水平升高，其水平变化可能与湿性ARMD的脉络新生血管生成有关。本研究结果显示，ARMD出血组血清miR-27a相对表达量显著高于对照组，提示miR-27a可能参与ARMD出血的发生发展。

表3血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值

表4血清miR-27a和NRF2表达与ARMD出血患者预后的关系

表5影响ARMD出血患者预后的因素分析

NRF2是广泛存在于心脏、肾等器官中的一种氧化还原平衡敏感转录因子，属于亮氨酸拉链转录激活因子家族，其相对分子质量为66kDa[19]。研究发现，其在抗氧化反应、炎症反应中发挥重要作用。有研究发现，NRF2在视网膜病变时起抗氧化应激作用，能够上调多种抗氧化物质的表达，在ARMD、糖尿病视网膜病变、青光眼等多种疾病中起保护视网膜血管及视网膜神经细胞的作用[20,21,22]。本研究结果显示，血清NRF2mRNA相对表达量显著低于对照组，提示NRF2可能参与ARMD出血的发生发展。本研究中ROC曲线分析表明，血清miR-27a和NRF2诊断ARMD出血的AUC分别为0.867、0.820,提示血清miR-27a和NRF2可作为评估ARMD出血发生的指标，且miR-27a表达水平对ARMD出血的诊断价值较NRF2高。为了更好诊断ARMD出血，本研究考察血清miR-27a和NRF2联合检测ARMD出血的价值，结果显示，两者联合检测ARMD出血的AUC为0.912,提示两者联合检测可更好地诊断ARMD出血。本研究还发现，高miR-27a组患者预后不良发生率明显高于低miR-27a组，高NRF2组患者预后不良发生率显著低于低NRF2组，提示miR-27a高表达和NRF2低表达与ARMD出血患者预后不良情况发生率密切相关。此外，Logistic回归分析结果显示，血清miR-27a高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的危险因素，血清NRF2高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的保护因素，提示对两者的监测可为ARMD出血患者预后评估提供一定临床依据。

综上所述，ARMD出血患者血清中miR-27a相对表达量明显升高，NRF2相对表达量明显降低，miR-27a和NRF2对ARMD出血具有一定诊断价值，且其表达情况与患者预后密切相关，提示二者可作为ARMD出血的早期诊断及预后评估的潜在生物学指标。

本研究尚有一些不足之处：(1)样本量较小；(2)尽管本研究中发现了miR-27a和NRF2的表达情况与ARMD患者预后密切相关，但详细的机制还有待进一步研究；(3)本研究的数据是基于ARMD患者的血清样本，外周血中miR-27a和NRF2含量的变化可能不完全符合局部组织中的变化，在后续的研究中将进一步扩大样本量，并进行组织和血液中miR-27a、NRF2表达量的比较，进一步研究miR-27a、NRF2在ARMD发表机制中的确切作用；(4)ARMD出血受多因素影响，miR-27a和NRF2可能只是一个方面，寻找更多影响ARMD出血因素及进一步了解各因素之间的相互关系还有待进一步的研究。

参考文献：

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[7]刘家琦,李凤鸣.实用眼科学.北京:人民卫生出版社2003:509

[15]阙喜妹,郗彦凤,王彤.Mir-27a高表达对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后的影响.中华疾病控制杂志2018;22(10):1004-1007

[16]张玲玲,杨芳.急性冠脉综合征患者血清miR-27a､miR-34a表达及与冠脉病变程度的相关性分析.河北医药2019;41(17):2625-2627,2631

[17]李宁宁,戴冰冰,雷蕾,等.原发性痛风性关节炎患者miR-23amiR-24-2和miR-27a的表达水平及调节机制.河北医学2019;25(8):1233-1237

[18]朱美江,任成达,蔡雯婷,等.外周血液中miRNA表达与老年性黄斑变性相关性研究.眼科新进展2019;39(7):677-681

[20]庞仪琳,张卫光,张艳,等.NF-E2相关因子2对视网膜细胞保护作用的研究进展.解剖学报2017;48(5):617-621

文章来源：周琨,赵宏,丁相奇,钱立峰,赵晓金,蔡萌.ARMD出血患者血清miR-27a和NRF2的表达与预后的相关性[J].国际眼科杂志,2021,21(06):1051-1055.