摘要:目的:检测年龄相关性黄斑变性(ARMD)出血患者血清微小RNA-27a(miR-27a)和转录因子E2相关因子(NRF2)的表达情况,并研究其相对表达量与ARMD出血患者预后的相关性。方法:采用回顾性病例对照研究,收集2018-06/2019-10在本院眼科确诊并治疗的ARMD出血患者80例为ARMD出血组,选取同期在本院进行常规检查的健康受试者80例为对照组。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测所有研究对象血清miR-27a和NRF2相对表达量;通过研究对象工作特征曲线(ROC)评估血清miR-27a和NRF2相对表达量对ARMD出血的诊断价值;分析患者预后不良情况发生率;采用Logistic回归分析ARMD出血患者预后不良的影响因素。结果:ARMD出血患者血清miR-27a相对表达量显著高于对照组(P<0.01),血清NRF2mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.01)。ROC结果显示,血清miR-27a和NRF2诊断ARMD出血的AUC分别为0.867、0.820,截断值分别为1.10、1.08,此时对应灵敏度分别为71.3%、91.3%,特异性分别为90.0%、63.7%。血清miR-27a和NRF2联合检测ARMD出血的AUC为0.912,此时对应灵敏度和特异性分别为86.3%、85.0%。高miR-27a组患者预后不良发生率明显高于低miR-27a组(P<0.05);高NRF2组患者预后不良发生率显著低于低NRF2组(P<0.05)。Logistic分析显示,血清miR-27a高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的危险因素,血清NRF2高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的保护因素。结论:miR-27a在ARMD出血患者血清中的相对表达量明显升高,NRF2相对表达量明显降低,两者对ARMD出血具有一定诊断价值,且其表达情况与患者预后密切相关,提示血清miR-27a和NRF2可作为ARMD出血的早期诊断及预后评估的潜在生物学指标。
引言
年龄相关性黄斑变性又称老年性黄斑变性(ARMD),是一种黄斑区视网膜组织退行性病变,是目前老年人视力损害和致盲的主要原因,根据病理类型分为干性ARMD和湿性ARMD,湿性ARMD的病理变化是脉络膜新生血管(CNV)形成,常伴有出血现象发生[1]。ARMD出血可引起患者中心视力下降,严重者可致盲[2]。目前临床上主要通过玻璃体内注射抗血管内皮因子治疗湿性ARMD,但无法有效治愈[3]。因此,探讨ARMD,尤其是ARMD合并出血的发病机制对患者的早期诊断、治疗及预后评估具有重要的意义。微小RNA-27a(microRNA-27a,miR-27a)是一种广泛存在于生物体内的非编码单链小分子RNA[4],研究表明miR-27a在调节机体各平衡中发挥重要作用[5]。转录因子E2相关因子(nuclearfactorerythroid-2-relatedfactor2,NRF2)是存在于细胞内的一种重要的转录因子,具有抗氧化反应、抗炎、神经保护、抗凋亡等多种作用[6]。然而miR-27a和NRF2在ARMD出血患者中的表达及与预后的关系不完全清楚。鉴于此,本研究拟通过检测ARMD出血患者血清miR-27a和NRF2的表达情况,并探究其表达水平与ARMD出血患者临床预后的关系,以期为临床早期诊断及治疗ARMD出血提供有价值的参考依据,现报告如下。
1、对象和方法
1.1对象
采用回顾性病例对照研究,收集2018-06/2019-10在本院眼科确诊并治疗的ARMD出血患者80例为ARMD出血组,纳入标准:(1)符合《实用眼科学》中制定的有关ARMD的相关诊断标准[7],伴有出血现象发生者;(2)年龄大于45岁;(3)患者选择在本院接受治疗者;(4)临床资料齐全者。排除标准[8]:(1)高度近视、眼部活动性炎症;(2)严重白内障,对患者视力产生严重影响;(3)黄斑前膜、黄斑裂孔、视网膜血管闭塞或中心性浆液性脉络膜视网膜病变;(4)近期确诊的感染、高血压、糖尿病、高血脂、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病等器质性病变;(5)临床随访资料不全者。同期选取在本院进行常规检查的健康受试者80例为对照组,纳入标准:(1)年龄大于45岁;(2)经体格检查体健,无心肝肾肺疾病、无风湿免疫系统疾病。排除标准:(1)有ARMD病史;(2)高度近视、眼部活动性炎症;(3)严重白内障,对患者视力产生严重影响;(4)黄斑前膜、黄斑裂孔、视网膜血管闭塞或中心性浆液性脉络膜视网膜病变;(5)近期确诊的感染、高血压、糖尿病、高血脂、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病等器质性病变。本研究经本院道德伦理委员会批准通过,所有样品采集均取得患者及家属知情并签署同意书,且符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》。
1.2方法
1.2.1主要试剂与仪器
离心机(货号:wi82487),购自于北京若水合科技有限公司;RNA提取试剂盒(货号:ml284600),购自于上海酶联生物公司;逆转录试剂盒(货号:KL266),购自于上海康朗生物科技有限公司;qRT-PCR试剂盒(货号:RR820A),购于北京宝日医生物技术有限公司;实时荧光定量PCR仪(型号:StepOneTM),购于美国应用生物系统公司;血清miR-27a和NRF2以及内参U6、GAPDH引物,由北京甘棠飞华生物科技有限公司合成;本研究中其他化学药品均购自上海锐塞生物技术有限公司。
1.2.2样品采集及保存
于清晨抽取所有受试者空腹状况下的静脉血5mL,离心后收集上层血清,置于-20℃冰箱中保存待测。
1.2.3血清miR-27a和NRF2的相对表达量
采用实时荧光定量PCR法(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)检测血清miR-27a和NRF2mRNA的相对表达量。具体操作步骤为:取待测血清,使用RNA提取试剂盒提取总RNA,然后经逆转录得到cDNA。以逆转录合成的cDNA为模板,进行qRT-PCR检测。PCR反应体系共10μL,上下游引物各0.2μL。PCR反应条件为:94℃,2min;94℃,30s;60℃,30s;74℃,35s,共40个循环。血清miR-27a和NRF2及内参U6、GAPDH的上下游引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法计算血清miR-27a和NRF2mRNA相对表达量,每个反应重复3次取平均值。
1.2.4随访及预后评估
对本研究中涉及到的所有患者治疗出院后进行门诊复查或电话随访,并根据相关标准对患者预后进行评估,随访时间为3mo,末次随访时间截止2020-01,以患者出现预后不良作为随访截止期,本次随访的中位随访时间为1.54mo,且本研究中未出现失访情况。
表1引物序列
预后评定:患者经治疗后视力无退化或好转为预后良好;患者治疗后视力持续退化为预后不良。
统计学分析:采用SPSS22.0进行统计学分析,计数资料用n(%)表示,组间比较采用卡方检验,计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验。采用研究对象工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristic,ROC)评估血清miR-27a和NRF2水平对ARMD出血的诊断价值。对ARMD出血患者发生不良预后的相关影响因素采用Logistic回归分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2、结果
ARMD出血组中男46例46眼,女34例34眼,年龄48~63(平均54.31±2.04)岁,体质量指数(bodymassindex,BMI)为21.83~22.49kg/m2。同期选取在本院进行常规检查的健康人群80例为对照组,其中男44例,女36例,年龄49~65(平均55.07±2.11)岁,BMI为21.71~22.37kg/m2。两组受试者性别、年龄、BMI等一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.1两组受试者血清miR-27a和NRF2相对表达量的比较
ARMD出血组血清miR-27a的相对表达量显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),血清NRF2mRNA相对表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。
2.2血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值
血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值见表3和图1。
2.3血清miR-27a和NRF2表达与ARMD出血患者预后的关系
分别以血清miR-27a和NRF2的截断值将ARMD出血患者分为高表达组和低表达组,其中高miR-27a组45例,低miR-27a组35例;高NRF2组37例,低NRF2组43例。高miR-27a组患者预后不良发生率明显高于低miR-27a组,差异有统计学意义(P<0.05);高NRF2组患者预后不良发生率显著低于低NRF2组,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。
2.4影响ARMD出血患者预后的因素分析
以ARMD出血患者预后不良是否发生为因变量(0=否,1=是),血清miR-27a和NRF2表达水平为自变量,采用逐步向前法,经Logistic回归分析,结果显示:血清miR-27a高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的危险因素(P<0.05),血清NRF2高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的保护因素(P<0.05),见表5。
3、讨论
ARMD是临床上常见的一种眼部疾病,属于致盲性退行性眼底病变[9]。ARMD出血是ARMD较为严重的一种,目前该疾病已成为老年人视力低下及致盲的主要原因[11]。流行病学研究显示,近年来随着中国人口老龄化程度的加深,患ARMD出血的患者呈逐年上升趋势,严重影响患者的健康及生活质量。然而,目前临床治疗ARMD出血的方法仍不完全有效,ARMD出血的早期诊断及治疗仍是医学者关注的热点。因此,寻找与ARMD出血相关的标志物,并探究其早期诊断及患者预后的相关性具有重要的临床意义[12]。
图1血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值。
表2两组受试者血清miR-27a和NRF2相对表达量的比较
目前已发现miRNA调节多种细胞功能并参与多种细胞通路,而视网膜细胞功能紊乱是导致ARMD疾病进展的关键因素。近期研究表明,miRNA如miR-17、miR-21、miR-27、miR-132、miR-204、miR-210、miR-296、miR-378、miR-519c和miR-15/107等均与ARMD的病程进展相关[13,14]。眼内miRNA的变化可能同时合并有血液中miRNA表达量的差异。因此研究外周血中miRNA在ARMD患者中表达量的差异对于发现ARMD的无创生物学标记物具有重要意义。miR-27a是miR-23a/27a/24-2簇家族的重要成员之一,位于第19号染色体上[15]。相关研究已证明,miR-27a与多种疾病的发生发展有关[16]。李宁宁等[17]研究发现,miR-27a在原发性痛风性关节炎患者中表达水平降低,其可作为炎症负性调控因子。朱美江等[18]研究发现miR-27a-3p在湿性ARMD患者外周血中表达水平升高,其水平变化可能与湿性ARMD的脉络新生血管生成有关。本研究结果显示,ARMD出血组血清miR-27a相对表达量显著高于对照组,提示miR-27a可能参与ARMD出血的发生发展。
表3血清miR-27a和NRF2对ARMD出血患者的诊断价值
表4血清miR-27a和NRF2表达与ARMD出血患者预后的关系
表5影响ARMD出血患者预后的因素分析
NRF2是广泛存在于心脏、肾等器官中的一种氧化还原平衡敏感转录因子,属于亮氨酸拉链转录激活因子家族,其相对分子质量为66kDa[19]。研究发现,其在抗氧化反应、炎症反应中发挥重要作用。有研究发现,NRF2在视网膜病变时起抗氧化应激作用,能够上调多种抗氧化物质的表达,在ARMD、糖尿病视网膜病变、青光眼等多种疾病中起保护视网膜血管及视网膜神经细胞的作用[20,21,22]。本研究结果显示,血清NRF2mRNA相对表达量显著低于对照组,提示NRF2可能参与ARMD出血的发生发展。本研究中ROC曲线分析表明,血清miR-27a和NRF2诊断ARMD出血的AUC分别为0.867、0.820,提示血清miR-27a和NRF2可作为评估ARMD出血发生的指标,且miR-27a表达水平对ARMD出血的诊断价值较NRF2高。为了更好诊断ARMD出血,本研究考察血清miR-27a和NRF2联合检测ARMD出血的价值,结果显示,两者联合检测ARMD出血的AUC为0.912,提示两者联合检测可更好地诊断ARMD出血。本研究还发现,高miR-27a组患者预后不良发生率明显高于低miR-27a组,高NRF2组患者预后不良发生率显著低于低NRF2组,提示miR-27a高表达和NRF2低表达与ARMD出血患者预后不良情况发生率密切相关。此外,Logistic回归分析结果显示,血清miR-27a高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的危险因素,血清NRF2高表达是影响ARMD出血患者发生预后不良的保护因素,提示对两者的监测可为ARMD出血患者预后评估提供一定临床依据。
综上所述,ARMD出血患者血清中miR-27a相对表达量明显升高,NRF2相对表达量明显降低,miR-27a和NRF2对ARMD出血具有一定诊断价值,且其表达情况与患者预后密切相关,提示二者可作为ARMD出血的早期诊断及预后评估的潜在生物学指标。
本研究尚有一些不足之处:(1)样本量较小;(2)尽管本研究中发现了miR-27a和NRF2的表达情况与ARMD患者预后密切相关,但详细的机制还有待进一步研究;(3)本研究的数据是基于ARMD患者的血清样本,外周血中miR-27a和NRF2含量的变化可能不完全符合局部组织中的变化,在后续的研究中将进一步扩大样本量,并进行组织和血液中miR-27a、NRF2表达量的比较,进一步研究miR-27a、NRF2在ARMD发表机制中的确切作用;(4)ARMD出血受多因素影响,miR-27a和NRF2可能只是一个方面,寻找更多影响ARMD出血因素及进一步了解各因素之间的相互关系还有待进一步的研究。
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文章来源:周琨,赵宏,丁相奇,钱立峰,赵晓金,蔡萌.ARMD出血患者血清miR-27a和NRF2的表达与预后的相关性[J].国际眼科杂志,2021,21(06):1051-1055.
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