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用高效液相色谱测定人血浆中西达本胺的浓度

2024-12-10 59 上传者：管理员

摘要：目的建立一种测定人血浆中西达本胺浓度的高效液相色谱方法。方法取血浆样品500μL,以曲安西龙为内标，用叔丁基甲醚进行液液萃取后，离心取上清液，氮气吹干后以水50μL复溶，再次离心后取10μL进样。色谱柱：Shim-pack CLC-ODS柱（150 mm×60 mm, 5μm）,流动相：水-乙腈=74∶26（冰醋酸调节pH=3）,流速：1.0 mL·min-1,柱温：35℃,紫外检测波长：260 nm。考察该方法的专属性、标准曲线、定量下限、精密度、回收率和稳定性。此外，应用上述高效液相色谱法测定1例患者口服西达本胺后的血浆药物浓度。结果西达本胺及内标的保留时间分别为8.00和9.40 min。测定方法在0.01～1.00μg·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=10.28x-0.06（r=0.998）,低、中、高浓度质控样品(0.02、0.15、0.75μg·mL-1)的日内、日间精密度（RSD）为1.00%～4.87%（n=6）,准确度在-10.29%～3.37%,平均提取回收率为61.74%～69.85%。结论本方法的灵敏度高，准确性好，简便快捷，适用于西达本胺的血药浓度监测。

关键词：
HDAC
HPLC
治疗药物监测
西达本胺
高效液相色谱法
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西达本胺是我国自主研发的1.1类新药，是全球首个口服亚型选择性组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制药，于2014年12月获得国家药品监督管理局(原中国食品药品监督管理局)批准用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤[1-3],2019年批准联合芳香化酶抑制药用于激素受体阳性、人表皮生长因子受体2阴性、绝经后、经内分泌治疗复发或进展的局部晚期或转移性乳腺癌患者[4]。本研究旨在建立一种测定人血浆中西达本胺浓度的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法，使之适用于临床样本分析。

一、材料与方法

1 药品与仪器

西达本胺对照品，纯度：97.8%,批号：FS1639982,购自天津阿尔塔科技有限公司；曲安西龙对照品，纯度：99.6%,批号：100333-201102,购自中国食品检定研究所。

高效液相色谱系统(配备LC-20AT泵、DGU-20A在线脱气机、SIL-20A自动进样器、SPD-20A可见紫外检测器、LC-solution色谱处理系统),均为日本岛津公司产品。

2 测定方法

本研究方法学建立和生物样本检测由北京协和医院药剂科实验室完成。

色谱条件色谱柱：Shim-pak CLC-ODS (150 mm×60 mm, 5 μm)柱，流动相：水-乙腈= (74 ∶26,v/v,冰醋酸调节pH=3),流速：1.0 mL·min-1,柱温：35 ℃,紫外检测波长：260 nm, 进样量：20 μL。

对照品工作液制备称取西达本胺对照品适量，精密称定，用二甲基亚砜溶解并定量稀释成1 mg·mL-1储备液，用水稀释，得质量浓度分别为0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg·mL-1标准曲线工作液。

内标工作液制备称取曲安西龙对照品，用二甲基亚砜溶解并定量稀释成1 mg·mL-1储备液，用水稀释，得质量浓度为5 μg·mL-1的内标工作液。

含药血浆制备分别取系列质量浓度西达本胺溶液50 μL,加空白血浆450 μL,加入2 mL的离心管中涡旋混匀，得系列质量浓度分别为0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500和1.000 μg·mL-1的西达本胺样本溶液。定量下限和低、中、高质量浓度血浆质控样品中的浓度分别为0.01、0.02、0.15和0.75 μg·mL-1。

血浆样品处理精密量取血浆工作液500 μL至2 mL EP管中，加入内标工作液10 μL,涡旋30 s, 加入叔丁基甲醚1 mL液液萃取后，以1.4×104r · min-1离心10 min, 吸取上清液，氮气吹干后以水50 μL复溶，以1.4×104r · min-1再次离心10 min, 吸取上清液30 μL至进样瓶。

3 方法学考察

专属性分别取6份不同来源的正常人空白血浆500 μL,不加内标，按“血浆样品处理”项下的方法进行处理，进样分析，得空白样品色谱图。另取空白血浆3份，一份加内标曲安西龙标准溶液，1份加分析物西达本胺标准溶液，一份同时加内标和分析物，同法处理，得相应色谱图。

标准曲线与定量下限含药标准曲线血浆按“含药血浆制备”项制备得到，按“血浆样品处理”项下的方法进行处理，进样分析。以西达本胺质量浓度为横坐标(x),西达本胺与内标的峰高比为纵坐标(y)拟合曲线，并考察定量下限。

精密度与回收率制备定量下限(0.01 μg·mL-1)、低(0.02 μg·mL-1)、中(0.15 μg·mL-1)、高(0.75 μg·mL-1)4种质量浓度的西达本胺质控样本，每个质量浓度6份，按“血浆样品处理”项下的方法进行操作，取样进行色谱分析，计算日内精密度；测定3个分批样品，每批作随行标准曲线，计算日间精密度。将测得峰高比值h代入标准曲线计算西达本胺浓度，并与真实浓度值对比，即为准确度。制备低、中、高(0.02、0.15、0.75 μg·mL-1)3种质量浓度质控样品，每个质量浓度各配制5份样品，按“血浆样品处理”项下的方法进行操作，作为回收率样品；另取空白血浆，按“血浆样品处理”项下方法操作(其中以超纯水代替内标溶液),随后加入西达本胺标准溶液及内标溶液，使之与定量下限及低、中、高浓度质控样品浓度相同，作为回收率对照样品。将上述样品进样，记录回收率样品峰面积比值(f1)及相应对照样品峰面积比值(f2),f1/f2即为提取回收率。

稳定性制备低、中、高的血浆质控样品，分别考察-60 ℃冻存15 d、反复冻融3次，4 ℃保存12 h情况下稳定性。

二、结果

1 方法学评价

专属性在上述条件下，西达本胺及内标曲安西龙的保留时间分别为8.00和9.40 min。血浆中内源性物质对目标分析物及其对应内标的测定无干扰，专属性好，其典型色谱图见图1。

标准曲线和定量下限西达本胺在0.01～1.00 μg·mL-1内，线性关系良好，其标准曲线方程为y=10.28x-0.06(r=0.998),定量下限为0.01 μg·mL-1。

精密度与回收率在低、中、高3种质量浓度下，西达本胺精密度在1.00%～4.87%,定量下限精密度在1.11%～2.97%,RSD均小于15%;在低、中、高3种质量浓度下，西达本胺准确度在-10.29%～3.37%,准确度均值在质控样本标示值的15%以内；在定量下限下，西达本胺准确度在15.21%～15.45%,在标示值的20%以内。在低、中、高3种质量浓度下，西达本胺的平均提取回收率为61.74%～69.85%。结果见表1。

稳定性西达本胺含药血浆质控样品-60 ℃冻存15 d, 反复冻融3次，4 ℃放置12 h各条件下相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)均小于15%,均值在质控样本标示值的15%以内，表明在上述条件下稳定。

2 方法学应用

采集1例受试者口服西达本胺后的肝素抗凝血浆样本，按照“血浆样品处理”项下的方法进行处理，测得峰高比值代入标准曲线计算西达本胺浓度，该患者血浆中西达本胺的质量浓度为0.11 μg·mL-1,色谱结果见图2。

图1血浆中西达本胺和内标的典型色谱图

表1用高效液相色谱法检测血浆中西达本胺的精密度和回收率(n=6)

图2患者血浆中西达本胺和内标的色谱图

三、讨论

对于西达本胺单药治疗的患者，接受西达本胺标准用药方案治疗，推荐服药每次30 mg, 2次/周，2次服药间隔≥3 d, 对于非标准用药的患者(包括已获得疾病缓解或移植后患者维持治疗)推荐用药方案为每次20 mg, 2次/周，2次服药间隔≥3 d。T细胞淋巴瘤患者口服30 mg西达本胺片后，血浆药物峰浓度(Cmax)在50～150 ng·mL-1,消除半衰期在17 h, 服药8次以上才存在一定有药物蓄积[5]。除此之外，西达本胺的Ⅰ期临床研究显示[6],患者易发生骨髓抑制等药物不良反应。西达本胺一般不单独用于患者的治疗，与其他化疗药物(如卡铂等)联用时，易增加患者严重骨髓抑制的发生风险，部分患者因严重血液学毒性而延迟治疗。本研究西达本胺方法学线性范围在0.01～1.00 μg·mL-1内，可进行西达本胺血浆峰浓度的监测，提供个体化给药方案，提高安全性。

目前，对于西达本胺的测定，国内外已报道的方法均为液相色谱串联质谱法，方法学涉及人血浆，大鼠血浆及脑脊液[7-9]。本研究首次用HPLC进行西达本胺的血浆样本测定，血浆预处理方法为液-液萃取，与现有文献[6-7]报道的乙腈沉淀蛋白方法相比，用氮气吹干后复溶的浓缩方式，保证最低定量下限点通过高效液相色谱仪器的有效测定，且液液萃取并未影响西达本胺的峰型。本研究还考察了不同比例乙腈对西达本胺与曲安西龙保留时间的影响，在保证酸定量的情况下，随着乙腈比例的增加，西达本胺与曲安西龙的保留时间均缩短，乙腈和水比例为28∶72时，两者的保留时间均小于9 min, 但是西达本胺与曲安西龙保留时间接近，影响西达本胺和曲安西龙的分离度。乙腈和水比例为27∶73时，西达本胺保留时间接近血浆固有杂质峰，因此，本方法用乙腈和水比例为26∶74,在该条件下，西达本胺与曲安西龙的保留时间分别为8.00和9.40 min, 分离度良好，各峰之间无干扰，基线平稳。

本研究首次建立了简便、灵敏、迅速的HPLC分析检测方法，为临床应用提供了方法学基础，未来希望有更大规模的西达本胺的药代动力学/药效学研究。

参考文献:

[5]马军,沈志祥,朱军,等.西达本胺治疗外周T细胞淋巴瘤中国专家共识(2018年版)[J].中国肿瘤临床,2018,45(15):763—768.

[7]闫珍,顾利强,徐晓珍,等.LC-MS测定大鼠脑脊液与血浆中西达本胺浓度及其药动学研究[J].中国现代应用药学,2023,40(3):342—350.

基金资助:中央高水平医院临床科研业务费基金资助项目(2022-PUMCH-B-060);

文章来源:于佳鑫,付强,刘鑫,等.用高效液相色谱测定人血浆中西达本胺的浓度[J].中国临床药理学杂志,2024,40(23):3449-3452.