血管内皮细胞具有分泌细胞因子、维持血管结构等多种功能，在肿瘤、严重感染、心血管系统疾病发生过程中均发现有血管内皮细胞损伤[1]。病理条件下，细胞分泌大量的炎性因子，合成活性氧自由基，细胞过度凋亡[2]。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）促进血管内皮细胞凋亡、氧化应激和炎性因子分泌[3]。龙胆苦苷提取自龙胆科植物，具有抗氧化、抗炎、杀菌等作用，临床上主要用于抗炎、健胃、保肝以及抗病原微生物的治疗[4]。研究发现，龙胆苦苷能够改善氧化应激下血管内皮细胞氧化损伤，龙胆苦苷可能具有血管内皮损伤保护作用[5]。龙胆苦苷能够通过抑制核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB）信号通路，从而抑制氧化应激和炎性反应[6]。人体内脑、肝、心、肺等多种组织均表达NF-κB,NF-κB负责调控氧化应激、细胞凋亡和炎性反应[7]。LPS可激活血管内皮细胞NF-κB信号通路，抑制NF-κB信号通路能够保护血管内皮细胞损伤[8]。本研究考察龙胆苦苷对LPS诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制，为其治疗感染等因素诱导的血管内皮损伤提供依据。

1、材料

1.1细胞

大鼠主动脉血管内皮细胞RAEC购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.2药品与试剂

龙胆苦苷（批号L-005，质量分数>98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；丙二醛检测试剂盒（批号BC0025）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）检测试剂盒（批号BC0175）、膜联蛋白V(AnnexinV）-异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanateisomer,FITC）/碘化丙锭（propidiumiodide,PI）细胞凋亡检测试剂盒（批号CA1020）购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗磷酸化p65(p-p65）抗体、兔抗剪切型半胱氨酸蛋白酶-3(cleavedCaspase-3）抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体购自英国Abcam公司；RPMI1640培养基（批号R8758）、胎牛血清（批号F2442）购自美国Sigma公司；PMA（批号GT6290）购自北京华越洋生物科技有限公司；引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

1.3仪器

MultiscanMK3酶标仪（美国ThermoFisherScientific公司）；FC500流式细胞仪（美国Beckman公司）；5424离心机、5810R离心机（德国Eppendrof公司）；LightCycler480荧光定量PCR仪（美国Roche公司）；PowerPac蛋白电泳仪、GelDocXR+凝胶显示系统（美国Bio-Rad公司）。

2、方法

2.1细胞培养

RAEC细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2龙胆苦苷对RAEC细胞活力的影响

取处于对数生长期的RAEC细胞，以3×103/孔接种至96孔板中，培养12h。设置对照组和龙胆苦苷（5、10、20、40、80μmol/L）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24h。每孔加入10μLCCK-8工作液，孵育2h，采用酶标仪检测490nm处的吸光度（A）值。

2.3龙胆苦苷对RAEC细胞增殖的影响

取处于对数生长期的RAEC细胞，以3×103/孔接种至96孔板中，培养12h。设置对照组、模型组和龙胆苦苷（5、10、20μmol/L）组，模型组和各给药组加入LPS(100μg/mL），各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24h。按“2.2”项下方法检测各组细胞活力。

2.4龙胆苦苷对RAEC细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的RAEC细胞，以1×103/孔接种至6孔板中，培养12h。设置对照组、模型组和龙胆苦苷（5、10、20μmol/L）组，模型组和各给药组加入LPS(100μg/mL），各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24h。收集细胞，以PBS溶液重悬，制成5×105/mL细胞悬液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，1h内采用流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况。

2.5龙胆苦苷对RAEC细胞丙二醛水平和SOD活性的影响

按“2.4”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书检测各组细胞丙二醛水平和SOD活性。

2.6龙胆苦苷对RAEC细胞肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6）和IL-1βmRNA表达的影响

按“2.4”项下方法处理细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：TNF-α上游引物5’-TGACAAGCC-TGTAGCCCATGTT-3’，下游引物5’-AGGGCAATG-ATCCCAAAGTAGA-3’;IL-6上游引物5’-CCAGTA-CCCCCAGGAGAAGAT-3’，下游引物5’-TTGCCTT-TTTCTGCAGGAAC-3’;IL-1β上游引物5’-AGTT-GCCTTCTTGGGACTGA-3’，下游引物5’-TCCAC-GATTTCCCAGAGAAC-3’;GAPDH上游引物5’-CCAGCAAAGAGACCAAGAGGAA-3’，下游引物5’-ATGGTACATAGACAAGGTGCGG-3’。

2.7龙胆苦苷对RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达的影响

按“2.4”项下方法处理细胞，收集细胞，加入RIPA裂解液，4℃、12000×g离心10min，收集上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封闭1h，分别加入p-p65和cleavedCaspase-3抗体（1∶600),4℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔抗体（1∶4000），室温孵育2h，加入ECL发光液显影。

2.8NF-κB信号激活剂（PMA）对龙胆苦苷促进RAEC细胞增殖的影响

取处于对数生长期的RAEC细胞，以3×103/孔接种至96孔板中，培养12h。设置对照组、模型组、龙胆苦苷（10μmol/L）组和龙胆苦苷（10μmol/L）联合PMA(1μmol/L）组，模型组和各给药组加入LPS(100μg/mL），各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24h。按“2.2”项下方法检测各组细胞活力。

2.9PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的RAEC细胞，以1×103/孔接种至6孔板中，培养12h。设置对照组、模型组、龙胆苦苷（10μmol/L）组和龙胆苦苷（10μmol/L）联合PMA(1μmol/L）组，模型组和各给药组加入LPS(100μg/mL），各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24h。按“2.4”项下方法检测各组细胞凋亡情况。

2.10PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞丙二醛水平、升高SOD活性的影响

按“2.8”项下方法处理细胞，按“2.5”项下方法检测各组细胞丙二醛水平和SOD活性。

2.11PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平的影响

按“2.8”项下方法处理细胞，按“2.6”项下方法检测各组细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达情况。

2.12PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达水平的影响

按“2.8”项下方法处理细胞，按“2.7”项下方法检测各组细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达情况。

2.13统计学分析

采用SPSS21.0软件分析数据，计量资料以s表示，用独立样本t检验和单因素方差比较。

3、结果

3.1龙胆苦苷对RAEC细胞活力的影响

如表1所示，与对照组比较，龙胆苦苷（5、10、20μmol/L）组细胞活力无明显变化，龙胆苦苷（40、80μmol/L）组细胞活力显著降低（P<0.05）。因此，选择5、10、20μmol/L龙胆苦苷进行后续研究。

3.2龙胆苦苷对RAEC细胞增殖和凋亡的影响

如图1和表2所示，与对照组比较，模型组细胞活力显著降低（P<0.05），细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与模型组比较，龙胆苦苷组细胞活力显著升高（P<0.05），细胞凋亡率显著降低（P<0.05),呈剂量相关性，表明龙胆苦苷可促进LPS诱导的RAEC细胞增殖并抑制其凋亡。

表1龙胆苦苷对RAEC细胞活力的影响

图1龙胆苦苷对RAEC细胞凋亡的影响

表2龙胆苦苷对RAEC细胞增殖和凋亡的影响

3.3龙胆苦苷对RAEC细胞丙二醛水平和SOD活性的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组细胞丙二醛水平显著升高（P<0.05),SOD活性显著降低（P<0.05）；与模型组比较，龙胆苦苷组细胞丙二醛水平显著降低（P<0.05),SOD活性显著升高（P<0.05），呈剂量相关性，表明龙胆苦苷可抑制LPS诱导的RAEC细胞氧化应激。

表3龙胆苦苷对RAEC细胞丙二醛水平和SOD活性的影响

3.4龙胆苦苷对RAEC细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达的影响

如表4所示，与对照组比较，模型组细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，龙胆苦苷组细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平显著降低（P<0.05），呈剂量相关性，表明龙胆苦苷可抑制LPS诱导的RAEC细胞炎性因子的表达。

表4龙胆苦苷对RAEC细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达的影响

3.5龙胆苦苷对RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达的影响

如图2和表5所示，与对照组比较，模型组细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，龙胆苦苷组细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达水平显著降低（P<0.05），呈剂量相关性，表明龙胆苦苷可抑制LPS诱导的RAEC细胞NF-κB信号通路的激活，并抑制细胞凋亡。

图2龙胆苦苷对RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达的影响

表5龙胆苦苷对RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达的影响

3.6PMA对龙胆苦苷促进RAEC细胞增殖以及抑制RAEC细胞凋亡的影响

如图3和表6所示，与龙胆苦苷组比较，龙胆苦苷联合PMA组细胞活力显著降低（P<0.05），细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。

3.7PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞丙二醛水平、升高SOD活性的影响

如表7所示，与龙胆苦苷组比较，龙胆苦苷联合PMA组细胞丙二醛水平显著升高（P<0.05),SOD活性显著降低（P<0.05）。

图3PMA对龙胆苦苷抑制血管内皮细胞凋亡的影响

表6PMA对龙胆苦苷促进血管内皮细胞增殖以及抑制细胞凋亡的影响

表7PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞丙二醛水平、升高SOD活性的影响

3.8PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平的影响

如表8所示，与龙胆苦苷组比较，龙胆苦苷联合PMA组细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平显著升高（P<0.05）。

3.9PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达水平的影响

如图4和表9所示，与龙胆苦苷组比较，龙胆苦苷联合PMA组细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。以上结果表明，PMA能够抑制龙胆苦苷改善RAEC细胞损伤的作用。

表8PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平的影响

图4PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达的影响

表9PMA对龙胆苦苷抑制RAEC细胞p-p65和cleavedCaspase-3蛋白表达的影响

4、讨论

龙胆苦苷为裂环环烯醚萜化合物，能够抑制氧化应激和炎性反应[4]。龙胆苦苷能够抑制氧化应激诱导的血管内皮细胞损伤和细胞凋亡[5]。本研究结果显示，与模型组比较，龙胆苦苷组细胞活力升高，细胞凋亡率降低，提示龙胆苦苷可能具有改善LPS诱导的血管内皮细胞损伤的作用。

LPS刺激血管内皮细胞损伤与氧化应激、炎性反应有关[9]。LPS诱导的血管内皮细胞中抗氧化酶的活性下降，抗氧化酶活性降低能够直接诱导氧自由基的大量聚集，过量的氧自由基能够刺激细胞，诱导脂质发生过氧化，导致氧化损伤；还能够激活细胞内的凋亡反应，促进细胞凋亡[10,11]。丙二醛水平可直接反应细胞氧化损伤程度[12]。SOD是氧自由基清除剂，也是主要的抗氧化酶之一[13]。Caspase蛋白家族被激活后形成凋亡级联反应，诱导细胞凋亡；Caspase-3是Caspase凋亡级联反应的下游执行因子，其被活化后是细胞凋亡的标志[14,15]。LPS诱导血管内皮细胞分泌炎性因子，促进炎性反应的产生并诱导细胞凋亡[16]。血管内皮细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子，诱导炎性损伤[17,18,19]。氧自由基过度积累可诱导炎性反应，并且炎性因子也可促进氧化应激[20,21]。本研究结果显示，模型组细胞丙二醛水平升高，SOD活性降低，cleavedCaspase-3蛋白表达水平降低，TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平升高；龙胆苦苷能够显著抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎性因子表达和氧化损伤，抑制细胞凋亡。

龙胆苦苷能够通过抑制NF-κB信号通路的激活发挥抗损伤作用[6]。本研究结果显示，龙胆苦苷组细胞p-p65蛋白表达水平降低。p65是NF-κB信号通路的关键亚单位，其表达量与NF-κB信号通路的激活水平有关[22]。NF-κB在炎性反应、细胞生长和氧化应激等过程中均有调控作用[23]。血管内皮损伤中NF-κB信号异常激活，抑制NF-κB信号通路能够缓解LPS诱导的血管内皮细胞损伤[7]。本研究结果显示，PMA能够抑制龙胆苦苷改善RAEC细胞损伤的作用，表明龙胆苦苷能够通过NF-κB信号通路发挥血管内皮细胞损伤保护作用。

综上，龙胆苦苷能够改善LPS诱导的血管内皮细胞损伤，其机制与抑制NF-κB信号通路有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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文章来源：胡志良,池豪,丁水印.龙胆苦苷对脂多糖诱导血管内皮细胞损伤的作用及机制[J].中草药,2021,52(10):3002-3008.

基金：河南省科学技术计划项目(2018225019)