自发性脑出血(ICH)是脑卒中第二常见的亚型，全球发病率约为24.6/10万[1]，可导致患者长期的功能损害，并具有较高的死亡率。脑出血后的血肿压迫和脑组织水肿被认为是影响患者预后的重要因素。近年来，临床研究证实了微创清除术(MIS)治疗脑出血的有效性，它可清除颅内血肿、降低颅内压、减轻继发性脑损伤、降低死亡率并改善预后[2,3,4]。然而微创清除术只能在一定程度上减轻血肿所造成的脑损伤，并不能完全消除早期或延迟形成的血肿周围脑水肿[5,6]。因此，用微创清除术清除脑血肿，再用药物预防继发性脑损伤可能是另一个最佳选择。二甲双胍(Metformin)是一种应用广泛、不良反应小的药物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和神经保护等作用[7,8,9]。课题组前期研究结果表明微创清除术联合二甲双胍能够减轻脑出血后继发性损害[10]，改善预后，但其具体机制尚不明确。为此，此次研究旨在进一步探讨微创清除术联合二甲双胍是否通过调控Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR-4)/核因子κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB)信号通路抑制炎症反应。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。

1.2 时间及地点

实验于2019年3月至2020年9月在山东省立第三医院转化医学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

清洁级健康雄性新西兰家兔48只，体质量2.0-2.5kg，购自济南西岭角养殖繁育中心，许可证号：SCXK(鲁)20150001，购入后在山东省立第三医院转化医学研究中心动物实验室常规饲养。

1.3.2 实验试剂

尿激酶购自广东丽珠药业有限责任公司；TLR4多克隆抗体、基质金属蛋白酶9多克隆抗体、核因子κB多克隆抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记的二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司；肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βELISA检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

1.3.3 实验仪器与设备

脑立体定位仪购于瑞沃德生命科技有限公司；InfiniteM200Pro酶标仪购于瑞士Tecan仪器有限公司；FluorChemR化学发光凝胶成像系统购于美国ProteinSimple公司；台式高速离心机Fresco21购于德国Thermo公司；BX51光学显微镜购于日本Olympus公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组

48只新西兰家兔随机分为4组，假手术组、模型对照组(脑出血组)、微创清除术组、微创清除术联合二甲双胍治疗组(微创清除+二甲双胍治疗组)，每组各12只。分别在造模后3d麻醉动物后处死，收集标本进行相关指标测定。

1.4.2 模型制备

除假手术组外，其余各组兔按照参考文献Sawyer定位法制作脑出血模型[11]。3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，置于兔脑立体定位仪上。移动兔脑立体定位仪上下标尺，调整家兔头部平面，使“十”字缝比“人”字缝高1.5mm，参照兔脑立体定位图谱确定内囊位置，取十字缝与人字缝交叉点为0点，以AP1/L6为穿刺点，深度约12mm。假手术组兔缓慢注入生理盐水0.3mL，其余各组兔分别于基底节注入兔耳中央动脉血0.3mL，留针10min后缓慢拔出。术后肌注青霉素(40万U)预防感染。3h后行CT扫描，可见基底节的高密度影，提示脑出血造模成功。

造模6h后，再次麻醉家兔，微创清除术组及微创清除+二甲双胍治疗组家兔在血肿位置注入5000U尿激酶(溶于0.5mL生理盐水中)0.1mL，针头置于原位20min后缓慢抽吸残留血液，术后再次进行CT扫描；脑出血组模拟微创清除手术过程，进行假性血肿清除，注入0.1mL生理盐水。术后微创清除+二甲双胍治疗组给予以二甲双胍(50mg/kg)，每日1次，连续灌胃3d，其余各组给予等量生理盐水灌胃。各组家兔分别在处死前2h行Purdy神经功能评分[12]，该评分最高为11分，最低为2分，评分越高说明神经功能损害越严重。

1.4.3 脑组织含水量的测定

各组家兔分别在实施相关处理后第3天麻醉后处死。迅速取脑血肿周围组织(100±10)mg，将脑组织置于称量杯中称取湿质量，然后再放入电热恒温箱(105℃)内烘烤24h至恒质量，测量干质量后计算脑含水量，脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.4.4 血脑屏障通透性的检测

各组家兔于实验前1h将2%伊文思蓝(EB)溶液(2mL/kg)注入耳缘静脉中，1h后麻醉下迅速断头取脑，取血肿周边组织并称质量(精确到0.1mg)，然后放入含有4mL甲酰胺的试管中，采用甲酰胺法测定脑组织中伊文思蓝含量，以判断血脑屏障损伤的严重程度，公式如下：脑组织中伊文思蓝含量(μg/g)=B×甲酰胺(mL)/湿质量(g)；式中B是指根据标准曲线的线性回归方程得出的样本伊文思蓝水平(mg/L)。

1.4.5 ELISA检测血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平

处死家兔前，心脏采血2mL,3000r/min离心10min，收集上清，-20℃冻存备用。按照ELISA试剂盒的说明书进行肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的检测，用酶标仪在450nm处检测吸光度。

1.4.6 免疫组化检测脑组织TLR4、基质金属蛋白酶9及核因子κB的表达

脑组织用40g/L多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片(4μm厚)，脱蜡水化后，体积分数3%过氧化氢处理，PBS冲洗，10mmol/L柠檬酸盐缓冲液煮沸修复。PBS冲洗后，分别加入TLR4、基质金属蛋白酶9和核因子κB一抗，4℃孵育过夜。PBS冲洗后，加入HRP标记的二抗，37℃孵育1h,DAB显色。苏木素复染，冲洗，经脱水、透明、封固后，光镜下观察。每张玻片均选5个高倍视野(×400)计数阳性细胞，取其平均值为该组标本的阳性细胞数。

1.4.7 WesternBlot检测脑组织TLR4、基质金属蛋白酶9及核因子κB蛋白的表达

处死兔后，迅速分离注射点周围脑组织，保存于-80℃环境备用。按照试剂盒说明书提取蛋白质，检测蛋白质浓度。然后进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿法转膜，加入一抗β-actin抗体(1∶1000)、TLR4抗体(1∶1000)、基质金属蛋白酶9抗体(1∶500)、核因子κB抗体(1∶500)4℃孵育，过夜，TBST漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液(1∶5000)，室温摇床2h。TBST漂洗，用FluorChemR化学发光凝胶成像系统扫描条带，使用Alphaview图像分析系统，β-actin为内参，目的条带的灰度值/β-actin条带的灰度值分析蛋白表达情况。

1.5 主要观察指标

(1)家兔脑组织含水量；(2)家兔血脑屏障通透性；(3)家兔血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平；(4)家兔血肿周围脑组织TLR4、基质金属蛋白酶9及核因子κB的表达。

1.6 统计学分析

采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行统计分析，符合正态分布及方差齐性的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

48只新西兰家兔随机分为4组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 自发性脑出血模型制备结果

在基底节注入血液后，家兔表现为对侧偏瘫，无法行走和爬行，对侧肢体对伤害性刺激的反应较低。脑CT显示基底神经节呈圆形或椭圆形高密度影，见图1，说明自发性脑出血模型是成功的。

2.3 各组兔Purdy评分、脑组织含水量及血脑屏障通透性比较

与假手术组相比，脑出血组Purdy评分、病灶周围脑组织含水量及伊文思蓝含量均明显升高(P<0.05)；与脑出血组相比，微创清除术组及微创清除+二甲双胍治疗组Purdy评分、病灶周围脑组织含水量及伊文思蓝含量均明显下降(P<0.05)，见表1。

2.4 各组兔血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达

与假手术组相比，其他组兔血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β表达均显著升高(P<0.05)；与脑出血组相比，微创清除术组和微创清除+二甲双胍治疗组兔血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达明显下降，其中微创清除+二甲双胍治疗组降低更明显(P<0.05)，见图2。

2.5 脑组织TLR4、基质金属蛋白酶9和核因子κB蛋白的表达

免疫组化染色显示，TLR4、基质金属蛋白酶9和核因子κB蛋白阳性表现为胞浆或胞核呈棕褐色。与假手术组相比，其他组兔脑组织TLR4、基质金属蛋白酶9和核因子κB蛋白表达显著升高(P<0.01)，与脑出血组相比，微创清除术组和微创清除+二甲双胍治疗组兔TLR4、基质金属蛋白酶9和核因子κB蛋白表达明显降低(P<0.05)，其中微创清除+二甲双胍治疗组蛋白表达下降更明显，见表2，图3,WesternBlot结果见图4。

3、讨论

自发性脑出血是一种严重的疾病，其病理生理学提示，早期广泛的血肿清除是预防继发性损伤和促进恢复的重要靶点。临床试验表明，微创清除术可借助尿激酶的溶解血肿作用，清除术后残留的血凝块，并促进其排出，从而提高血肿清除率，有效清除患者的血清炎症因子，并促进神经功能恢复[13,14]。

研究发现二甲双胍在脑缺血、脑外伤及脑出血等脑损伤中具有神经保护作用[9,15]，可通过抑制氧化应激和神经炎症减轻脑损伤后的脑水肿，并减轻血脑屏障的破坏[16]，其机制可能是通过激活AMPK，诱导抗氧化剂硫氧还蛋白的表达，降低活性氧水平[17]；也可通过AMPK依赖性和非依赖性途径抑制核因子κB信号通路来延缓炎症反应[18]。因此，核因子κB介导的炎症通路的抑制可能是二甲双胍神经保护的机制之一[19]。此次研究中，作者利用脑出血动物模型探讨了微创清除术后给予二甲双胍治疗对脑组织TLR4、基质金属蛋白酶9、核因子κB蛋白、血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达水平以及Purdy评分、EB含量和脑组织含水量的影响。结果显示，微创清除+二甲双胍治疗组家兔血脑屏障通透性减低及脑水肿、神经功能损害程度减轻最明显。说明微创清除术联合二甲双胍治疗对脑出血后继发脑损伤有较好地预防作用。

炎症反应是脑出血时发生脑损伤的重要病理因素之一。TLR4是TLRs家族的重要成员[20]，在中枢神经系统的各种细胞类型中均可表达，在炎症反应中发挥关键作用[21]。转录因子核因子κB是一种蛋白复合物，作用于TLR4下游，是参与调节炎症和先天免疫反应的关键转录因子[22]，它通过一系列炎症细胞因子和趋化因子的mRNA表达来控制最终的免疫炎症反应。在静息细胞中，核因子κB与一种抑制蛋白κB(IκB)结合，并保留在细胞质中。不同诱因的细胞刺激会触发TLR/MyD88/NF-κB信号转导通路[23]，激活IKK(IκB激酶)后，活化的IKK会泛素化、磷酸化并降解IκB-α，使得核因子κB两个亚单位从失活状态活化，并从细胞质转移到细胞核内，与相应的炎症相关基因结合，启动炎性细胞因子的转录，促进炎性因子或递质的合成和释放，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、基质金属蛋白酶9等，最终导致炎症和疾病的发生[24,25]。

肿瘤坏死因子α可以促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症进展[26]。白细胞介素1β可诱导小胶质细胞和巨噬细胞分化为M1型细胞，进一步促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的分泌，引发炎症级联反应，诱发脑炎症，加重血脑屏障的损伤[27,28]。基质金属蛋白酶9可由多种类型的细胞以及浸润中性粒细胞和淋巴细胞等释放，可使细胞基膜成分降解，介导单核细胞等穿过血管向靶器官浸润，促进炎症反应及组织损伤。基质金属蛋白酶9增多也可破坏紧密连接蛋白和基底膜蛋白，在血脑屏障的破坏中发挥关键作用[29]。研究表明，在脑出血、脑卒中后基质金属蛋白酶9的表达上调，导致血脑屏障的通透性增加[30]、血管源性水肿和出血[31,32]。小鼠蛛网膜下腔出血后，基质金属蛋白酶9在脑内表达上调，可通过TLR4依赖的方式介导血脑屏障通透性的增加，使蛋白质和溶质从脑血管系统外渗到脑内的细胞外间隙，促进水肿形成，使炎症反应持续，并造成进一步的神经元损伤；抑制TLR4的表达，可抑制基质金属蛋白酶9表达的上调，并抑制血脑屏障通透性的增加[33]。此次研究发现，在微创清除术的基础上联合二甲双胍治疗脑出血家兔后，TLR4、核因子κB、基质金属蛋白酶9、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β表达水平均较模型组明显降低，因此，推测微创清除术联合二甲双胍可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而减轻炎症反应。当然，此次研究的样本量较小，需要进一步详细的实验研究来证明微创清除+二甲双胍和TLR4/NF-κB信号通路在脑出血进展中的作用及机制。

综上所述，微创清除术联合二甲双胍可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低炎症因子或递质肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及基质金属蛋白酶9的表达，从而改善血脑屏障的通透性，减轻脑水肿。因此，微创清除脑血肿后再使用二甲双胍预防继发性脑损伤可能为脑出血的治疗提供了实验依据，但仍需更多的研究来了解其对神经保护作用的确切机制。

参考文献:

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文章来源：徐林,齐宏顺,葛汝村,李培培,甄丽晓,冯肖亚.微创清除术联合二甲双胍对家兔脑出血炎症反应的影响[J].中国组织工程研究,2022,26(11):1741-1746.