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人造血干细胞在不同氧浓度下生长、凋亡状况的差异观察

2020-08-11 106 上传者：管理员

摘要：目的：研究不同氧浓度下人造血干细胞（HSCs）生长及凋亡状况的差异，探究不同氧浓度对HSCs生长的抑制作用。方法：将HSCs分别在不同氧浓度下培养，3%、5%、15%氧浓度作为实验组，20%氧浓度作为对照组。分别培养4、7、10d，研究红系集落形成单位（CFU-E）集落数；分别培养6、12、24h，观察HSCs细胞凋亡情况。结果：培养4、7、10d,5%氧浓度组CFU-E集落数最高，3%和5%氧浓度组与对照组CFU-E集落数比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。培养6h,5%氧浓度组HSCs凋亡率最低，3%和5%氧浓度组与对照组HSCs凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；培养12h,5%氧浓度组HSCs凋亡率最低，5%和15%氧浓度组与对照组HSCs凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；培养24h,5%氧浓度组HSCs凋亡率最低，3%和5%氧浓度组与对照组HSCs凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。培养4、7、10d，氧浓度变动与CFU-E集落数均呈正相关（P<0.05）。培养6、12、24h，氧浓度变动与HSCs凋亡率均呈正相关（P<0.01）。结论：不同氧浓度对HSCs的生长和凋亡有直接影响。5%的氧浓度能促进HSCs生长，同时又能抑制HSCs凋亡。

关键词：
人造血干细胞
凋亡
氧浓度
生长
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人造血干细胞（HSCs）在不同因素直接影响下增殖、分化成各种细胞，如骨髓组织细胞、淋巴组织细胞、白细胞、红细胞、上皮组织细胞等。HSCs具备不停自我更新和变异的潜力。1988年THOMSON等[1]在实验室成功建立了胚胎干细胞系。从此以后，HSCs在实验室被进一步培养为多种细胞，包括骨细胞、软骨细胞[2]、血细胞、神经细胞、肌肉细胞、胰岛细胞等[3,4]。基于HSCs优良的不断增殖和多向分化能力，在组织损伤重建的研究中HSCs表现出突出的作用[5]。与此同时，在临床修复治疗中HSCs的多向分化性也获得了广泛应用。在干细胞的培养条件中环境因素至关重要，不同的环境因素包括氧浓度、pH值、温度、渗透压等，均能影响干细胞的增殖与分化。氧浓度对干细胞的生长和凋亡有至关重要的影响，JOBIN等[6]的研究发现，在体外培养的低氧环境下，干细胞的生长受到明显干预。本研究主要观察HSCs在人体外培养的状况下，在不同氧浓度中的生长和凋亡情况，为将来的基础性试验与临床应用提供一定依据。

1、材料与方法

1.1材料

HSCs由上海拜沃生物科技有限公司提供。RPMI1640培养液（上海钰森生物技术有限公司）、MethoCultTMHCC4230培养基（加拿大StemcellTechnologiesInc公司）、IMDM培养基（上海北诺生物科技有限公司）、二氧化碳培养箱（长沙长锦科技有限公司）、AnnextinV（美国Becton,DickinsonandCompany）、微氧手套箱（COYLaboratoryProducts公司）、6孔培养板（广州洁特生物过滤股份有限公司）、AnnexinV-FITC细胞凋亡检验试剂盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）、CKC-TR-2W型倒置显微镜（Olympus,Japan）、YJ-875型超净化工作台（苏州安泰净化设备厂）、BD-CAN7型流式细胞仪（美国Becton,DickinsonandCompany）。

1.2方法

1.2.1细胞培养

HSCs用10%胎牛血清的RP-MI1640培养液培养。

1.2.2不同氧浓度的细胞培养处置方式

将HSCs分为实验组和对照组。实验组细胞在微氧手套箱中培养的氧浓度分别设定为：3%、5%、15%；对照组细胞在微氧手套箱中培养的氧浓度设定为20%。

1.2.3红系集落形成单位（CFU-E）集落培养

采用MethoCultTMHCC4230培养基，0.9mL培养基加入0.1mL的细胞悬液（细胞密度2×109个/升），用IM-DM培养基补足为1mL，充分混匀后转移至35mm的6孔培养板，每份标本重复5孔，置不同氧浓度，37℃饱和湿度的培养箱内，培养4、7、10d时分别计数CFU-E集落数。

1.2.4流式细胞仪检测HSCs凋亡率

采用10%胎牛血清的RPMI1640培养基，0.9mL培养基加入0.1mL的细胞悬液（细胞密度2×109个/升），用IM-DM培养基补足为1mL，将HSCs在不同氧浓度下分别培养6、12、24h，使用AnnexinV-FITC细胞凋亡检验试剂盒，通过BD-CAN7型流式细胞仪检测HSCs凋亡率。

1.2.5相关性分析

氧浓度为3%、5%、15%、20%分别记作3%氧浓度组、5%氧浓度组、15%氧浓度组、对照组。培养4、7、10d时研究不同氧浓度和CFU-E集落数的相关性；培养6、12、24h时研究不同氧浓度和HSCs凋亡率的相关性。

1.3统计学处理

采用SPSS19.0统计软件对数据进行分析处理。符合正态分布的计量资料以表示，不同时间、不同氧浓度下统计数据比较采用LSD-t检验；相关性采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1人造血干细胞

倒置显微镜下观察分离培养的人血干细胞，见图1。

图1人造血干细胞（HE×400)

2.2CFU-E集落数结果

培养4、7、10d,5%氧浓度组CFU-E集落数最高，3%和5%氧浓度组与对照组CFU-E集落数比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1各组CFU-E集落数比较

2.3不同氧浓度组HSCs凋亡率比较

培养6h,5%氧浓度组HSCs凋亡率最低，3%和5%氧浓度组与对照组HSCs凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；培养12h,5%氧浓度组HSCs凋亡率最低，5%和15%氧浓度组与对照组HSCs凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；培养24h,5%氧浓度组HSCs凋亡率最低，3%和5%氧浓度组与对照组HSCs凋亡率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图2流式细胞仪测定HSCs凋亡率

2.4不同氧浓度和CFU-E集落数、HSCs凋亡率相关性分析

2.4.1分别培养4、7、10d，不同氧浓度和CFU-E集落数相关性分析

培养4、7、10d氧浓度变化与CFU-E集落数均呈正相关（r=0.486、0.848、0.813,P<0.05）。

2.4.2分别培养6、12、24h，不同氧浓度和HSCs凋亡率相关性分析

培养6、12、24h后氧浓度变动与HSCs凋亡率均呈正相关（r=0.743、0.785、0.773,P<0.01）。

3、讨论

HSCs在增殖、分化、凋亡过程中受不同环境因素的影响，包括温度、氧浓度、渗透压、pH值等，其中至关重要的一项因素就是氧浓度，而最容易忽视的一项因素也是氧浓度。在不同氧浓度下，HSCs的生物学行为显现出多种多样。有科学研究推测出HSCs在人体内最适宜生存的微环境不是常氧状态，而是低氧状态[7,8]。低氧状态是人体内普遍存在的一种生理环境，因此，也促进了人体内细胞的发育及多种病变的转变[9]。目前，国际和国内对于HSCs的体外培养，普遍采用常氧状态，而体内低氧状态与实验室中的常氧状态有巨大差异，却较少有研究关注低氧状态下HSCs的增殖、分化、凋亡情况。因此，本研究选用不同氧浓度培养HSCs，可更为真实地模拟人体内不同的真实生存环境状态。

HSCs在自我修复、更新及分化方面有明显优势。同时，HSCs的增殖、复制、归巢后重建造血、多向分化、凋亡等生物学方面的功能也受周围各种环境因素的广泛制约[10,11]。在人体内骨髓环境中为低氧状态，而这正是HSCs主要的生存区域[12,13]。人体内的这种低氧状态，对于HSCs生物学方面的基本功能的持续保持起关键作用[14,15,16]。有研究发现，低氧状态会促进神经干细胞的增殖，与此同时神经干细胞的凋亡却出现明显抑制效果[17]。人体内部的低氧诱导因子（HIF)-1是细胞在低氧状态下适应与应答调节中的主要转录因子，HIF-1在细胞的生长、增殖、分化、凋亡等生物学活动中起举足轻重的作用。HIF-1有α和β2个亚基，常氧状态下，因为被蛋白酶系统降解的原因，HIF-1α在细胞质内处于失活状态。而在低氧状态下，HIF-1α大量聚集活化，同时转移到细胞核内，与细胞核内的HIF-1β相结合构成HIF-1分子，进而辨识、结合其中包含有低氧化学反应元件的DNA序列，从而介导、调节和管控与低氧反应所涉及基因的表达[18]。在人体内骨髓中平均氧浓度为5%，静脉血平均氧浓度为12%～15%，动脉血平均氧浓度为20%。本研究将体外培养环境中各组氧浓度分别设定为3%、5%、15%、20%，正是要模拟HSCs在人体内不同氧浓度下的生长、凋亡状况。而这方面的研究工作国际和国内的报道相对较少。

4、结论

本研究发现，HSCs分别培养4、7、10d，其中5%氧浓度组CFU-E集落数最高；分别培养6、12、24h，其中5%氧浓度组HSCs凋亡率最低。由此推测，不同氧浓度对HSCs的生长和凋亡有直接影响，而其中5%氧浓度能促进HSCs的生长，同时也能抑制HSCs的凋亡，可为今后的临床应用和实验室研究提供一定理论依据。

参考文献：

[2]周晓红,杨鑫.人造血干细胞在不同氧浓度下凋亡情况及体外诱导分化为软骨细胞的观察研究[J].医药前沿,2017,24(7):115-117.

[10]邹仲之,李继承.组织学与胚胎学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013:36-37.

[11]邓雅文,朱刚,贾书花.人造血干细胞的临床应用研究[J].长治医学院学报,2018,32(1):74-76.

叶果,杨鑫.人造血干细胞在不同氧浓度下生长､凋亡状况观察研究[J].国际检验医学杂志,2020,41(15):1822-1825.