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3种药敏检测方法对洋葱伯克霍尔德菌体外抗菌药物药敏试验的结果分析

2020-08-12 910 上传者：管理员

摘要：目的：评估微量肉汤稀释法、纸片扩散法和E-test法检测洋葱伯克霍尔德菌体外抗菌药物药敏试验的结果。方法：采用微量肉汤稀释法、纸片扩散法和E-test法检测31株洋葱伯克霍尔德菌对复方磺胺甲噁唑、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素、左氧氟沙星和美罗培南这6种抗菌药物的药敏性。以微量肉汤稀释法为参考方法，计算50%最低抑菌浓度（MIC50）、敏感率和误差率，分析基本一致率和分类一致率。结果：复方磺胺甲噁唑的MIC50为1.00μg/mL，敏感率为100.0%，体外活性最好。头孢哌酮/舒巴坦的MIC50为16.00μg/mL，敏感率只有61.3%，体外活性最差。以微量肉汤稀释法为参考方法，E-test法检测头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦和左氧氟沙星的基本一致率和分类一致率均<90.0%，且存在一定的误差率，其中左氧氟沙星的非常重大误差为6.5%，头孢哌酮/舒巴的重大误差为12.9%；纸片扩散法检测头孢他啶和头孢哌酮/舒巴坦的分类一致率<90.0%，且存在一定的误差率，其中米诺环素的非常重大误差为6.5%，头孢哌酮/舒巴坦的重大误差为12.9%;E-test法和纸片扩散法检测复方磺胺甲噁唑和美罗培南敏感率均>90.0%，分类一致率均>90.0%。结论：微量肉汤稀释法、纸片扩散法和E-test法检测洋葱伯克霍尔德菌可能存在不同的误差，应合理选择药敏检测方法，以确保结果的准确性。

关键词：
E-test法
洋葱伯克霍尔德菌
纸片扩散法
药敏试验
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洋葱伯克霍尔德菌是一种常见的医院获得性感染条件致病菌，包括新洋葱伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌、稳定伯克霍尔德菌、污染伯克霍尔德菌等[1]。洋葱伯克霍尔德菌可引起免疫缺陷患者的严重感染，尤其是在囊性纤维化患者中；还可引起以坏死性肺炎、败血症和整体预后差为特征的“洋葱综合征”[2]。由于临床上抗菌药物和免疫抑制剂的广泛使用，使得洋葱伯克霍尔德菌对抗菌药物多重耐药甚至全耐药[2,3]。碳青酶烯类亚胺培南及3代头孢菌素的使用会增加洋葱伯克霍尔德菌检出和定植的发生。本研究以微量肉汤稀释法为参考方法，评估纸片扩散法和E-test法检测洋葱伯克霍尔德菌体外抗菌药物药敏试验的结果。

1、材料与方法

1.1临床菌株

收集2017年3月至2018年8月从苏州大学附属第一医院临床分离的洋葱伯克霍尔德菌30株，从盐城市第三人民医院分离1株，共31株为研究对象。其中来自痰15株（48.39%），咽拭子10株（32.25%），全血3株（9.68%），引流液1株（3.23%），伤口1株（3.23%），分泌物1株（3.23%）。通过质谱仪鉴定31株伯克霍尔德菌属，其中多噬伯克霍尔德菌15株（48.39%），洋葱伯克霍尔德菌13株（41.93%），越南伯克霍尔德菌1株（3.23%），污染伯克霍尔德菌1株（3.23%），新洋葱伯克霍尔德菌1株（3.23%）。同一患者同一标本中多次分离的相同菌株不重复计数。

1.2质控菌株

铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922。

1.3仪器与试剂

法国梅里埃公司的VITEKMS全自动微生物质谱鉴定仪和法国梅里埃公司的VITEK2compact全自动微生物鉴定系统，微量肉汤稀释法和E-test法药敏试剂均购自温州市康泰生物科技有限公司，纸片扩散法药敏试剂购自赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。

1.4药敏结果判定及标准

按照美国临床和实验室标准协会（CLSI)M10028th抗微生物药敏试验的执行标准进行操作及药敏结果判读，其中头孢哌酮/舒巴坦纸片扩散法、微量肉汤稀释法、E-test法最低抑菌浓度（MIC）值参考肠杆菌头孢哌酮折点标准。以微量肉汤稀释法为参考方法，基本一致率（EA）为被评估方法的MIC值与微量肉汤稀释法MIC值相差不超过1个稀释度的菌株百分比；分类一致率（CA）为被评估方法的药敏结果（敏感、中介、耐药）与微量肉汤稀释法一致的菌株百分比；非常重大误差（VME）为被评估方法将耐药报告为敏感；重大误差（ME）为被评估方法将敏感报告为耐药；小误差（MI）为被评估方法将中介报告为耐药或敏感，或将耐药、敏感报告为中介。可接受范围：CA≥90.0%,EA≥90.0%,VME≤1.5%,ME≤3.0%,MI≤10.0%[4]。

1.5统计学处理

本研究采用Excel进行数据分析；计数资料以率（%）进行描述性统计分析。

2、结果

2.1抗菌药物MIC值和敏感率

复方磺胺甲噁唑是体外抗洋葱伯克霍尔德菌群最有效的抗菌药物50%MIC(MIC50）为1.00μg/mL，敏感率为100.0%；然后是米诺环素，MIC50为1.00μg/mL，敏感率高达96.8%；美罗培南MIC50为4.00μg/mL，敏感率为90.3%；头孢他啶和左氧氟沙星MIC50分别为2.00、1.00μg/mL；敏感率均为83.8%；而头孢哌酮/舒巴坦MIC50为16.00μg/mL，仅仅只能抑制61.3%的洋葱伯克霍尔德菌生长。复方磺胺甲噁唑、米诺环素和美罗培南3种检测方法的体外敏感率比较接近，且敏感率均>90.0%；而头孢他啶和头孢哌酮/舒巴坦的微量肉汤稀释法敏感率却低于E-test法和纸片扩散法；左氧氟沙星的微量肉汤稀释法敏感率高于E-test法。见表1。

表131株洋葱伯克霍尔德菌对6种抗菌药物的MIC和敏感情况

2.26种抗菌药物的误差率

以微量肉汤稀释法为参考方法，纸片扩散法检测6种抗菌药物中美罗培南和复方磺胺甲噁唑的误差最小，VME和ME均为0.0%,MI为9.7%；米诺环素的VME最高，达6.5%；头孢哌酮/舒巴坦的ME为12.9%,MI为16.1%；头孢他啶MI为12.9%，略高于标准。见表2。

表2纸片扩散法检测的误差率和CA

以微量肉汤稀释法为参考方法，E-test法检测6种抗菌药物中美罗培南、米诺环素和复方磺胺甲噁唑无误差，头孢他啶的误差比较小，ME为3.2%,MI为6.5%；头孢哌酮/舒巴坦的误差最大，ME为12.9%,MI为12.9%；左氧氟沙星的误差率略高，MI为6.5%,VME为6.5%。见表3。

表3E-test法检测的误差率和CA

2.36种抗菌药物的EA%和CA%

在log2(-1～1）范围内，以微量肉汤稀释法为参考方法，E-test法检测美罗培南和复方磺胺甲噁唑的EA为>90.0%，头孢哌酮/舒巴坦的EA为80.5%，米诺环素和头孢他啶的EA为74.1%、77.4%，左氧氟沙星仅为67.7%。美罗培南、复方磺胺甲噁唑和米诺环素3种方法的CA均>90.0%，左氧氟沙星的CA范围为83.8%～100.0%，头孢他啶的CA范围为83.8%～87.1%。见表2～4。

表4在log2(-1～+1）范围内E-test法基本一致率

3、讨论

洋葱伯克霍尔德菌是引起医院感染的重要致病菌[5]，包括菌血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、脓肿等，同时也是引起肺囊性纤维化和慢性肉芽肿的重要致病菌[6]。目前，临床上分离到的洋葱伯克霍尔德菌越来越多，在非发酵革兰阴性杆菌中位于第4位，仅次于不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌[7]。洋葱伯克霍尔德菌对许多抗菌药物天然耐药，且耐药机制比较复杂。一些国内外学者认为洋葱伯克霍尔德菌的耐药机制主要为[2,8,9]:(1）细胞膜渗透性降低；（2）细胞的主动外排；（3）通过底物裂解或化学修饰使酶失活；（4）点突变引起的靶点改变、减少或缺失；（5）以耐药靶替代易感目标，进行代谢旁路；（6）通过增加转录或基因增殖使产生的靶点过量；（7）特异性结合蛋白的药物隔离作用。为及时准确地报告药敏结果，指导临床合理用药，本研究采用法国梅里埃公司的VITEKMS全自动微生物质谱鉴定仪鉴定并确认洋葱伯克霍尔德菌。通过微量肉汤稀释法、E-test和纸片扩散法来检测洋葱伯克霍尔德菌的药敏结果。

微量肉汤稀释法被认为是“金标准”[10]。纸片扩散法具有操作简单、价格便宜等优点，在日常的药敏试验工作中应用非常广泛。本研究显示，纸片扩散法和E-test法检测洋葱伯克霍尔德菌对复方磺胺甲噁唑无论是MIC50、敏感率、误差率、EA，还是CA结果都很好，但从操作和经济方面考虑，纸片扩散法最适宜。复方磺胺甲噁唑和米诺环素敏感性最好，与文献报道一致[11,12]。但是米诺环素纸片扩散法的VME较高（6.5%），与茅国峰等[13]研究报道纸片扩散法结果不一致，主要原因为：（1）四环素类药物纸片扩散法存在中介和耐药假性增高的问题，这是由四环素类药物的化学性决定的；（2）此次研究的菌株数量比较少，可能存在随机误差。因此，为了结果的准确性，应该扩大研究菌株的数量。同时，有资料表明，米诺环素对人体的伤害性较大，临床用此药应当慎重[14]。左氧氟沙星由于2017年CLSI取消了纸片扩散法的折点，所以只能测定其MIC值。头孢他啶尽管纸片扩散法MI略高，为12.9%，但是MIC50、敏感性、CA和误差比较小，可能是标本量比较少的原因，存在随机误差。头孢哌酮/舒巴坦的CA<90.0%，与茅国锋等[13]研究结果一致，头孢哌酮/舒巴坦的ME>3.0%,MI>10.0%，可能与没有具体的CLSI折点有关。

综上所述，临床上有洋葱伯克霍尔德菌感染者，E-test法、纸片扩散法检测洋葱伯克霍尔德菌体外药敏试验结果显示，不同的方法检测可能存在不同的误差，应合理选择药敏检测方法，以确保结果的准确性。

参考文献：

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[8]付玉华,朱文秀,杜希利,等.98株洋葱伯克霍尔德菌临床分布及耐药性[J].中国感染控制杂志,2017,16(3):215-217.

[9]茅国峰,何秋丽,杨国灿.洋葱伯克霍尔德菌携带整合子的分布与耐药性关系[J].中国消毒学杂志,2016,33(8):742-745.

[11]刘亚丽,张戈,徐英春,等.5种国产与进口E-test药敏条的一致性比较[J].临床检验杂志,2016,34(11):827-830.

[13]茅国峰,梁美春.评估纸片扩散法与Vitek-2Compact仪器法检测洋葱伯克霍尔德菌体外药敏[J/CD].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2018,12(6):570-576.

[14]牛俊杰,姬文娟,于拽拽,等.2017年临床分离常见细菌耐药性监测报告[J].临床医药实践,2018,27(12):933-937.

李莹,陶运娟,徐杰,任亚璐,陈旭.3种药敏检测方法对洋葱伯克霍尔德菌体外抗菌药物药敏结果分析[J].检验医学与临床,2020,17(15):2160-2163.