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雷公藤红素对人卵巢癌细胞株HEYa8增殖、凋亡的影响及其作用机制
摘要：目的：探讨雷公藤红素对人卵巢癌细胞株HEYa8增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法：采用MTT法检测不同浓度和时间雷公藤红素对HEYa8细胞增殖的影响。将HEYa8细胞随机分为:雷公藤红素组(0.4mg/L,培养24h)和对照组(未处理)。检测两组细胞的生长迁移情况、细胞分裂指数及细胞数量。利用Westernblotting检测雷公藤红素激活凋亡并抑制肿瘤细胞的现象及分子机制。结果：雷公藤红素在浓度为0.4mg/L培养24h时效果最佳。雷公藤红素组侵袭细胞、细胞分裂指数、细胞数量及CD44及GSDMS-N双阳性细胞占总细胞百分比较对照组低(P<0.05),凋亡相关蛋白相对表达量较对照组高(P<0.05)。雷公藤红素组PI3K/Akt信号通路关键分子的蛋白表达量较对照组低(P<0.05)。结论：雷公藤红素能够抑制HEYa8细胞生长并诱导细胞凋亡,其分子机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。
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我国每年约有5.2万女性被确诊为卵巢癌,约2.2万人死于卵巢癌,并且过去10年卵巢癌发病呈年轻化趋势[1]。卵巢癌具有易增殖、侵袭性高等特点,这也往往是临床治疗失效的原因,因此抑制卵巢癌细胞增殖及侵袭是治疗卵巢癌的要点与难点之一[2,3]。雷公藤红素是从我国传统中药雷公藤中提取的单体,具有良好的安全性。有学者前期研究发现,其抑制肿瘤血管生成、肿瘤增殖及侵袭效果较好[4,5,6,7]。同时有报道显示,肿瘤细胞发生凋亡可以有效抑制肿瘤生长[8,9]。但是,雷公藤红素抑制肿瘤生长是否与细胞凋亡有关鲜有报道。因此,本研究以人卵巢癌细胞株HEYa8作为研究对象,研究雷公藤红素对HEYa8细胞增殖和凋亡的影响,并探究其分子机制,以期为临床攻克卵巢癌提供新思路。
1、材料与方法
1.1实验材料及试剂
雷公藤红素购自上海Aladdin公司,HEYa8人卵巢癌细胞株购自美国ATCC公司。培养基DMEM及胎牛血清FBS均购自美国Gibco公司,MTT试剂购自美国ThermoFisher公司,IGF-1购自美国R&D公司,GSDMS-N购自美国SantaCruzBiotechnology公司,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18及CD44购自美国Abcam公司,IL-1β、GAPDH、PI3K及Akt购自美国CellSignalingTechnology公司。
1.2HEYa8人卵巢癌细胞株培养
将含有12%胎牛血清和1%青链霉双抗的DMEM培养基培养HEYa8细胞,置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养,根据细胞生长状态换液及传代。
1.3MTT法测定雷公藤红素处理的最适浓度及时间
把雷公藤红素浓度分为8个梯度,分别为0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20及2.40mg/L(药物用培养基溶解),并分别作为0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20及2.40mg/L组。同时也把培养时间分为5个梯度,分别为0、12、24、48及72h。细胞进行96孔板铺板,边缘孔用无菌PBS填充,每组设置6个重复孔。隔夜培养后第2天加入梯度药物,随后进行梯度时间培养。每组到时间后加入20μlMTT(5mg/ml)培养4h,终止培养后吸去残液并加入150μlDMSO(37℃震荡10min)。最后用酶标仪检测490nm波长处的吸光度值,得到的数值用Prism7软件处理。
1.4实验分组
本实验分为对照组和雷公藤红素组,对照组为未经任何处理的HEYa8人卵巢癌细胞,雷公藤红素组根据MTT结果得到最适处理浓度及时间,应用雷公藤红素处理HEYa8细胞。在机制实验部分,应用PI3K特异性激动剂(IGF-1)后,分为IGF-1(+)雷(+)组(同时加入IGF-1和雷公藤红素)、IGF-1(-)雷(+)组(只加入雷公藤红素)和IGF-1(+)雷(-)组(只加入IGF-1)[10]。
1.5Transwell法测定细胞迁移、细胞分裂指数及细胞计数
在24孔板配套的Transwell小室里接种5×104个/孔细胞,用无血清培养基培养,小室以下孔板用血清培养基培养。培养12h后,利用0.1%结晶紫染色小室细胞,观察侵袭细胞的数量并拍照计数。细胞培养24h后,加入秋水仙素0.1μg/ml后再培养40min,随后显微镜下观察1000个细胞中分裂期细胞(洋葱状)数量,并用百分比表示。细胞培养24h后,用细胞计数仪分别测算两组细胞的数量。
1.6Westernblotting检测
采用Westernblotting检测凋亡相关蛋白(GSDMS-N、Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18)和PI3K/Akt信号通路关键节点蛋白(PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt)相对表达量。用预冷PBS洗净细胞,再用RIPA+PMSF裂解细胞并提取蛋白,之后进行制胶电泳及转模。孵育一抗过夜,GSDMS-N(1∶500),NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-18(1∶800),IL-1β、GAPDH、PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt(1∶1000),之后用TBST洗净,再孵育相应二抗2h,随后拍照。所得条带用ImageJ软件分析,用Prism7软件处理数据。
1.7免疫荧光双标检测
细胞先用PBS洗净,随后用4%多聚甲醛溶液固定,再用3%Triton孵育10min,GSDMS-N(1∶1000)过夜,第2天用相应荧光二抗孵育后再用CD44(1∶1000)孵育,用相应二抗孵育室温2h,孵育10min的DAPI(1∶1000)。最后用PBS清洗,再用荧光显微镜拍照,数据用ImageJ及Prism7软件分析处理。
1.8qRT-PCR
采用Trizol法提取细胞总RNA,逆转录,依据RevertAidRTReverseTranscriptionKit(美国ThermoFisher公司)试剂盒说明书将定量1μg逆转录为cDNA,随后qRT-PCR检测每组细胞内NLRP3、ASC、IL-1β及Caspase1的表达量。NLRP3正向引物:5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'(21bp),反向引物:5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'(21bp),IL-1β正向引物:5'-CCTTGTGCAAGTGTCTGAAGC-3'(21bp),反向引物:5'-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3'(21bp),ASC正向引物:5'-GACGGGGCCAATACCACAC-3'(18bp),反向引物:5'-TCTGTAACAAAAGTCGTGCTTCT-3'(23bp),Caspase1正向引物:5'-TGGGTGCAGGCACAATAAATG-3'(21bp),反向引物:5'-TTGAGGCAAGTTGAGGGTCTT-3'(21bp),GAPDH正向引物:5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'(21bp),反向引物:5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'(22bp)。qRT-PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,37℃退火60s,72℃延伸120s,共计40个循环。荧光半定量分析过程:依次加入cDNA、引物及Q-PCRMix,最后进行荧光半定量分析。数据采用Prism7软件处理。
1.9统计学方法
数据分析采用SPSS19.0统计软件。计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,比较用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1不同浓度及培养时间雷公藤红素对HEYa8细胞生存率的影响
不同浓度雷公藤红素作用12、24、36、48和72h的HEYa8细胞生存率比较,经重复测量设计的方差分析,结果如下:①不同时间点的细胞生存率比较,差异有统计学意义(F=135.130,P=0.000);②不同浓度组的细胞生存率比较,差异有统计学意义(F=74.860,P=0.000);③不同浓度组的细胞生存率变化趋势比较,差异有统计学意义(F=2.604,P=0.043)。最终选择0.4mg/L浓度雷公藤红素处理24h来进行本实验。见表1和图1。
表1不同浓度组各时间点细胞生存率比较
图1不同浓度组的细胞生存率变化趋势
2.2雷公藤红素对HEYa8细胞侵袭性及增殖性的影响
雷公藤红素组与对照组侵袭细胞、细胞分裂指数及细胞数量比较,差异有统计学意义(P<0.05),雷公藤红素组侵袭细胞、细胞总的数量较对照组少,而细胞分裂指数低于对照组。见表2和图2、3。
表2雷公藤红素组与对照组侵袭细胞、细胞分裂指数及细胞数量比较(x¯±s)
图2雷公藤红素组与对照组侵袭细胞比较
图3雷公藤红素组与对照组细胞分裂指数比较
2.3雷公藤红素对HEYa8细胞凋亡的影响
雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05),雷公藤红素组较对照组高(见表3和图4～6)。雷公藤红素组与对照组CD44/GSDMS-N双阳性细胞占总细胞百分比分别为(38.33±6.0)%和(61.67±4.4)%,经t检验,差异有统计学意义(t=3.351,P=0.033),雷公藤红素组较对照组低。
表3雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白相对表达量比较(x¯±s)
图4雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白的表达
2.4雷公藤红素对PI3K/Akt信号通路的影响
雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt信号通路关键分子的蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05),雷公藤红素组较对照组低。见表4和图7、8。
2.5各组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1mRNA及蛋白相对表达量的变化
各组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1mRNA相对表达量比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05),IGF-1(+)雷公藤红素(+)组与IGF-1(-)雷公藤红素(+)组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各组凋亡关键因子NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1蛋白相对表达量比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05),IGF-1(+)雷公藤红素(+)组与IGF-1(-)雷公藤红素(+)组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、6和图9～11。
图5雷公藤红素组与对照组凋亡蛋白相对表达量比较
图6雷公藤红素组与对照组免疫荧光双标检测
表4雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt信号通路关键分子的蛋白相对表达量比较(x¯±s)
图7雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt信号通路关键分子的蛋白相对表达量的变化
图8雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt信号通路关键分子蛋白的表达
表5各组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1mRNA相对表达量比较(x¯±s)
表6各组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1蛋白相对表达量比较(x±s)
图9各组蛋白的表达
图10各组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1mRNA相对表达量的变化
图11各组NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase1蛋白相对表达量的变化
3、讨论
卵巢癌因其恶性程度高、侵袭性强等特点,并且一般临床发现已到中晚期,留给患者的选择几乎只有手术与化疗[1,2]。雷公藤红素是具有多种生物活性的天然产物,来源于传统中药雷公藤的根皮,应用历史甚久,毒副作用较弱,目前主要应用在抗癌的抑制肿瘤血管新生方面[3]。虽然何冰玉等[6]和张亚南等[7]前期研究发现,雷公藤红素具有良好的抑制卵巢癌生长的作用,然而抗癌的分子机制还不甚明了。
细胞凋亡是一种新型程序性细胞死亡方式[11]。有研究表示,提高肿瘤细胞凋亡水平可以有效抑制肿瘤生长与增殖,肿瘤细胞凋亡可能是抑制肿瘤细胞生长增殖的新方向[12]。有学者研究发现,提高卵巢癌细胞的凋亡水平可有效抑制肿瘤细胞的侵袭、生长与分裂,这可能与细胞凋亡后α-NETA杀伤活性被激活等因素有关[13]。笔者研究发现,用雷公藤红素最适合治疗浓度作用HEYa8细胞,可以降低细胞侵袭性,减少细胞分裂指数并减少总的细胞数量,这与前期研究结果基本吻合,证明了雷公藤红素确实有抑制卵巢癌细胞生长的作用。随后发现,在雷公藤红素作用下细胞凋亡关键因子Caspase1水平升高,这可能与雷公藤红素诱导HEYa8细胞凋亡有关。因为细胞凋亡是一种依赖于Caspase1的细胞死亡,Caspase1在凋亡中扮演重要角色[14]。其中前体Caspase1需要通过NLRP3小体(包括NLRP3及ASC等分子)的切割才能转化为具有活性的Caspase1,并且Caspase1的作用主要是在于活化IL-1β和IL-18,从而激活细胞自身的炎症反应[15]。然而,IL-1β和IL-18等炎症因子还受到GSDMD的控制,GSDMD活化成为GSDMD-N后,可以在细胞膜上形成孔道,使细胞内炎症内容物外放[16]。炎症内容物外放后可以导致肿瘤细胞的增殖被抑制,甚至死亡,这也是很多研究报道的细胞凋亡与肿瘤被抑制的机制[12,13]。同样的,笔者发现雷公藤红素可以较好地提升凋亡相关蛋白的水平,也提高了GSDMD-N阳性细胞的比例,这些都说明雷公藤红素可以提高肿瘤细胞凋亡水平。有研究报道,细胞凋亡的发生可能与经典的PI3K/Akt信号通路相关,即抑制此信号通路可以有效提高细胞凋亡水平[17,18,19]。笔者发现雷公藤红素在HEYa8细胞中可以抑制此信号通路,并且用PI3K特异性激活剂(IGF-1)激活此通路后,雷公藤红素的促细胞凋亡作用消失,这提示雷公藤红素诱导细胞凋亡可能抑制了PI3K/Akt信号通路。
综上所述,雷公藤红素具有较好的HEYa8细胞抑制作用,引起此现象是因为雷公藤红素激活了肿瘤细胞的凋亡,这个过程可能与其抑制PI3K/Akt信号通路高度相关。然而,本实验的分子机制研究依旧有限,缺乏深层次的在体研究等,还需要进一步实验探索。
参考文献：
[6]何冰玉,张亚南,苏荣健,等.雷公藤红素通过活性氧诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的研究[J].中药新药与临床药理,2018,29(4):443-448.
[7]张亚南,何冰玉,苏荣健,等.雷公藤红素通过逆转EMT抑制SKOV-3细胞的侵袭转移[J].中药药理与临床,2018,34(4):36-40.
马著妍,吴田田,吴彤,王悦,张蕴莉.雷公藤红素对卵巢癌细胞增殖､凋亡的影响及作用机制研究[J].中国现代医学杂志,2020,30(16):15-22.
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