脊髓损伤是一种毁灭性的疾病,通常导致患者终身残疾[1]。据统计,全球约有250万人受脊髓损伤的影响[2]。脊髓损伤后,脊髓回路下行通路断开,导致其失去运动相关突触输入[3],严重影响患者对运动的控制[4]。目前,脊髓损伤的治疗仍是临床和基础科学研究的最大挑战之一[5],迫切需要开发新疗法。MicroRNA(miRNA)在多种疾病中起重要调控作用,已有多项研究证实其在脊髓损伤中的表达及功能[6]。WANG等[7]研究表明,miR-21-5p介导脊髓损伤后纤维瘢痕的形成,促进脊髓损伤恢复。YANG等[8]研究表明,少突胶质细胞前体细胞移植可促进大鼠脊髓损伤后的功能恢复,进一步检测发现其功能恢复与miR-375-3p、miR-1-3p、miR-363-3p等表达水平改变有关。ZHAO等[9]研究表明,miR-124促进骨髓间充质干细胞分化为神经源性细胞,加速脊髓损伤恢复。miRNA的异常表达被认为与大鼠脊髓损伤功能恢复相关,miR-92a、miR-202、miR-132、miR-451、miR-27b、miR-208、miR-17、miR-128、miR-107、miR-223等被报道在大鼠脊髓损伤组织中表达异常[2,5,6,10,11,12]。然而,miRNA在脊髓损伤后运动功能恢复中的作用报道较少。

本研究复制大鼠脊髓损伤模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)在大鼠脊髓损伤组织中筛选出目标miRNA,进一步研究该miRNA在大鼠脊髓损伤后运动功能恢复中可能的分子机制,为脊髓损伤的精准治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

6周龄清洁级雄性Spregue-Dawley大鼠84只,体重200～250g,动物许可证号:SCXK(京)2011-0001,由昆明医科大学实验动物中心提供。所有实验程序获昆明医科大学动物保护与使用委员会批准。24℃恒温环境饲养,12h明暗交替,自由饮水进食。按照随机对照动物实验方法,将84只实验大鼠随机分为2批,第一批30只分为假手术组和脊髓损伤组,每组15只;第二批54只分为假手术组、对照组(脊髓损伤+miR-92amimicsnegativecontrol)和实验组(脊髓损伤+miR-92amimics),每组18只。本实验2017年4月—2018年7月在昆明医科大学科研实验中心完成。

1.1.2实验细胞

大鼠小胶质细胞BV-2(货号:RAT-CELL-0077)购自武汉原生原代生物医药科技有限公司。将细胞置于添加10%胎牛血清、100u/ml青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中,37℃、5%二氧化碳条件下常规培养。

1.1.3主要仪器及试剂

倒置显微镜(日本Olympus公司),qRT-PCR仪(美国赛默飞世尔公司)。多聚甲醇(美国Hyclone公司),Triton(美国远慕生物公司),TUNEL染色混合液(瑞士Roche公司),RIPA裂解液、BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),PTEN抗体、Caspase-3抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和β-actin抗体(英国Abcam公司),Trizol(日本TaKaRa公司),水合氯醛、TaqMan™MicroRNA逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司),miR-92amimics、miR-92amimicsnegativecontrol(广州锐博生物科技有限公司),Lipofectamine®2000、双荧光素酶报告基因试剂盒(美国赛默飞世尔公司)。

1.2实验方法

1.2.1复制大鼠脊髓损伤模型

第一批大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后,脊髓损伤组在T9～T10水平进行椎板切除手术,在不破坏硬脑膜的情况下暴露脊髓,随后夹紧T8和T11的棘突以稳定脊柱,使用纽约大学冲击器[5]对暴露在外的脊髓背侧表面进行挫伤损伤(10g×25mm);假手术组大鼠采用T10椎板切除术,未出现体重下降。

1.2.2miR-92amimics干预

第二批实验组大鼠在脊髓损伤后立即髓鞘内注射miR-92amimics(1μl/h,20nmol/ml),持续3d;对照组大鼠脊髓损伤后鞘内注射等量miR-92amimicsnegativecontrol,方法同实验组。

1.2.3BBB评分评估大鼠术后行为

在脊髓损伤后第1、3、7、14、21和28天,采用BBB评分评估大鼠后肢运动功能。评分采用双盲法,由3位经验丰富的评分人独立完成,最终取3人评分的均值。

1.2.4TUNEL染色检测细胞凋亡情况

取脊髓组织切片于室温下固定20min,PBS清洗30min,随后4℃、0.1%TritonX-100透化2min。PBS清洗2次,加入TUNEL染色混合液,37℃条件下避光孵育1h,加入1μg/mlDAPI,室温下避光孵育10min。清洗后甘油封片,在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.2.5Westernblotting检测PTEN和凋亡相关蛋白

术后第28天取脊髓,截取包含损伤中心的1cm脊髓段,使用RIPA裂解液提取脊髓组织或BV-2细胞中总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度,配制12%分离凝胶,每个泳道加入30μg蛋白样品。电泳后,转膜至PVDF膜上,室温封闭2h。加入一抗:PTEN抗体(1∶1000)、Caspase-3抗体(1∶1000)、Bax抗体(1∶1000)、Bcl-2抗体(1∶1000)、β-actin抗体(1∶1000),4℃孵育过夜。次日,加入抗大鼠IgG辣根过氧化物酶偶联二抗(1∶2000),4℃孵育90min。使用UVP凝胶成像系统成像、ImageJ软件分析蛋白条带灰度值,实验重复3次。

1.2.6qRT-PCR检测miRNAs和PTENmRNA

术后第28天取脊髓,使用Trizol提取脊髓损伤组织总RNA并确定总RNA的纯度和浓度,使用逆转录试剂盒将miRNAs和PTENmRNA逆转录为cDNA,取适量cDNA配置PCR反应体系,miRNAs以U6为内参,PTENmRNA以GAPDH为内参,引物序列见表1。实验重复3次,采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。

表1qRT-PCR引物序列

1.2.7双荧光素酶报告基因验证miR-92a与PTEN的靶向关系

构建包含miR-92a和PTEN-3'UTR结合位点的PTEN-3'UTR(PTEN-WT),以及不含该结合位点的PTEN-3'UTR(PTEN-MUT)载体质粒。将BV-2细胞接种于24孔板中(2×105个/孔),使用Lipofectamine2000试剂共转染,分为对照组(载体质粒+miR-92amimicsnegativecontrol)和实验组(载体质粒+miR-92amimics)。转染48h后测定荧光素酶活性,实验重复3次。

1.3统计学方法

数据分析采用SPSS20.0统计软件。计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,比较采用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析,方差分析的两两比较用LSD-t检验;相关性分析用Pearson法,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1大鼠脊髓损伤模型评估

脊髓损伤组与假手术组大鼠第1、3、7、14、21、28天BBB评分比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间点的BBB评分有差异(F=103.273,P=0.000);②假手术组与脊髓损伤组的BBB评分有差异(F=93.474,P=0.000),假手术组BBB评分较高;③两组BBB评分变化趋势有差异(F=59.057,P=0.000)。见表2。

表2两组大鼠各时间点BBB评分比较(n=15,x¯±s)

表3两组大鼠细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平比较(n=15,x±s)

脊髓损伤组与假手术组大鼠细胞凋亡率比较,经t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3和图1。

脊髓损伤组与假手术组大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达量比较,经t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3和图2。

图1两组大鼠脊髓组织中细胞凋亡情况（TUNEL染色×200)

图2两组凋亡相关蛋白相对表达量比较

2.2大鼠脊髓组织中miRNAs的异常表达

脊髓损伤组与假手术组大鼠miR-92a、miR-132、miR-128、miR-107、miR-17、miR-202、miR-451表达水平比较,经t检验,差异有统计学意义(P<0.05);miR-27b、miR-208、miR-223表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4和图3。

表4两组大鼠脊髓组织中miRNAs的表达水平比较(n=15,x±s)

图3两组大鼠脊髓组织中miRNAs表达水平比较

2.3miR-92a促进大鼠脊髓损伤运动功能恢复并抑制细胞凋亡

假手术组、对照组、实验组大鼠第1、7、14和28天的miR-92a表达水平比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间点的miR-92a表达水平有差异(F=78.341,P=0.000);②3组miR-92a表达水平有差异(F=53.409,P=0.000),实验组miR-92a表达水平最高(P<0.05);③3组miR-92a表达水平变化趋势有差异(F=31.351,P=0.000)。见表5。

假手术组、对照组、实验组大鼠第1、3、7、14、21和28天的BBB评分比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间点的BBB评分有差异(F=44.751,P=0.000);②3组BBB评分有差异(F=76.832,P=0.000),假手术组BBB评分最高(P<0.05);③3组BBB评分变化趋势有差异(F=52.059,P=0.000)。见表6。

表53组大鼠各时间点miR-92a表达水平比较(n=18,x±s)

表63组大鼠各时间点BBB评分比较(n=18,x±s)

3组大鼠细胞凋亡率比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=23.015,P=0.000);对照组高于假手术组和实验组。见表7和图4。

3组大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2水平比较,经方差分析,差异有统计学意义(F=26.909、33.417和29.053,均P=0.000);对照组Caspase-3、Bax高于假手术组和实验组,Bcl-2低于假手术组和实验组。见表7和图5。

表73组大鼠细胞凋亡率及Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平比较(n=18,x±s)

图43组大鼠脊髓组织中细胞凋亡情况（TUNEL染色×200)

图53组大鼠凋亡相关蛋白相对表达量比较

2.4PTEN是miR-92a的靶基因

对照组与实验组大鼠PTEN-WT荧光活性比较,经t检验,差异有统计学意义(t=4.816,P=0.000),实验组低于对照组;两组PTEN-MUT荧光活性比较,差异无统计学意义(t=0.173,P=0.864)。见表8。

对照组与实验组大鼠PTENmRNA和蛋白相对表达量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=5.654和3.058,P=0.000和0.004),实验组低于对照组(见表8和图6)。PTEN与miR-92a表达水平呈负相关(r=-0.876,P=0.000)(见图7)。

表8两组大鼠PTEN-WT和PTEN-MUT荧光活性以及PTENmRNA和蛋白相对表达

图6两组大鼠PTEN蛋白相对表达量比较

图7PTEN与miR-92a的相关性散点图

3、讨论

脊髓损伤常导致患者运动功能受损,严重时可导致残疾、瘫痪甚至死亡[13]。然而,目前尚未有一种疗法可以有效地阻止脊髓损伤的发展进程[14]。近年来,对miRNAs的研究提示其可能在脊髓损伤恢复中扮演着重要角色[15],为脊髓损伤恢复的分子机制研究提供了新思路。YU等[16]研究表明,miR-133b在成年斑马鱼脊髓损伤组织中高表达,对其脊髓损伤后的功能恢复至关重要。miR-133b靶向轴突生长抑制剂RhoA,使用吗啉反义寡核苷酸抑制miR-133b的表达,导致脊髓损伤的成年斑马鱼运动功能恢复,NMLF、SRF和IMRF神经元轴突减少。YI等[17]研究表明,miR-155缺乏会抑制Th17细胞分化,促进脊髓损伤后的运动功能恢复。BHALALA等[18]研究表明,小鼠脊髓损伤后,miR-21呈时间依赖性升高,病变区域的星形胶质细胞表达高水平miR-21。敲除miR-21可促进脊髓损伤后胶质瘢痕形成,从而促进脊髓损伤恢复。WANG等[19]研究表明,cAMP是3条参与坐骨神经损伤调节、促进神经突触生长的信号通路的上游调控因子。miR-142-3p可通过AC9诱导cAMP升高,促进神经突生长,有助于脊髓损伤后的感觉功能恢复。本研究发现miR-92a在大鼠脊髓损伤组织中低表达,过表达miR-92a有助于脊髓损伤大鼠运动功能恢复并抑制细胞凋亡。

PTEN作为一个脊髓损伤后负调节因子,可抑制脊髓损伤后的神经新生[20]和轴突再生[21],同时PTEN在细胞增殖、凋亡和神经元分化方面也发挥重要作用。YAN等[22]研究表明,PTEN通过激活Wnt/β-catenin通路,抑制胰腺炎细胞增殖和迁移。MATSUDA等[23]报道,过表达PTEN通过抑制PI3K/Akt信号通路,抑制细胞凋亡。LEE等[24]研究表明,PTEN可通过抑制ERK信号与S6K信号的相互作用,促进神经元分化。有研究表明,PTEN在脊髓损伤组织中高表达[25],敲除PTEN可促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复[26,27]。HU等[28]研究表明,miR-21靶向PTEN抑制脊髓损伤大鼠细胞凋亡。本研究发现,PTEN是miR-92a的一个靶基因,在大鼠脊髓损伤组织中表达上调。大鼠脊髓损伤组织中,PTEN与miR-92a表达水平呈负相关。

综上所述,miR-92a可能通过调节PTEN促进大鼠脊髓损伤后的运动功能恢复。PTEN是miR-92a的靶基因,miR-92a可能通过调节PTEN从而促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。受实验设备、研究时长等因素影响,本研究有不足之处,后期将进一步完善。

黄伟,钱锦锋,蔡执中,姜叶飞.MicroRNA-92a对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响[J].中国现代医学杂志,2020,30(16):7-14.