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头颈部鳞癌中钙粘蛋白11的相关作用研究

2020-08-18 279 上传者：管理员

摘要：目的：研究钙粘蛋白11在头颈部鳞状细胞癌细胞中的表达情况，以及CDH11对HNSCC细胞功能的影响。方法：应用Western印迹法检测在HNSCC细胞系及正常细胞中CDH11的表达差异，检测应用转染技术降低CDH11表达后，HNSCC细胞中上皮间充质转化标志物表达水平的变化情况，并对转染后的细胞形态、增殖能力及侵袭能力进行测定。结果：HNSCC细胞中的CDH11及E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达高于正常细胞，Twist家族转录因子-1(TwistfamilyBHLHtranscriptionfactor1,Twist-1）表达低于正常细胞，提示高水平CDH11可能抑制上皮间充质转化过程。转染后，HNSCC细胞中E-钙粘蛋白表达降低，Twist-1表达升高，且细胞间粘附降低；细胞增殖能力较转染前均增强（P<0.05）；细胞侵袭能力较转染前有所提高（P<0.05）。结论：CDH11通过抑制HNSCC细胞的上皮间充质转化过程，进而抑制了HNSCC的增殖和侵袭行为，提示CDH11在HNSCC中可能作为抑癌基因起作用。

关键词：
Western印迹法
增殖
头颈部鳞状细胞癌
钙粘蛋白-11
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头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）简称头颈部鳞癌，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，且发病率逐年上升。Bray等[1]于2018年统计的癌症报告显示，HNSCC全球发病人数约355000例，死亡人数约177000例，在美拉尼西亚的发病率最高。诱发HNSCC的原因众多，包括遗传倾向、化学制剂、辐射、吸烟、饮酒等[2]。在过去的30年里，尽管HNSCC的治疗有了很大的改善，但5年生存率仍然很低，仅为50%～55%[1]。因此，寻找HNSCC发生、发展的潜在影响因子，帮助预测肿瘤行为和指导治疗是亟须解决的难题。

钙粘蛋白11(CDH11），也称成骨细胞钙粘蛋白，是一种Ⅱ型经典钙粘蛋白，其首次在成骨细胞中被发现，是一种参与细胞-细胞粘附的完整膜蛋白，可能在骨的发育和维持中发挥作用[3]。有研究表明，CDH11在前列腺癌和乳腺癌中促进侵袭和转移，尤其是在乳腺癌中，由于癌细胞对高度表达CDH11的成骨细胞的高亲和力，使CDH11促进癌细胞的骨转移[4,5]。然而在食管癌、结直肠癌和胃癌中，CDH11被甲基化沉默，并具有抑癌作用，能抑制食管癌和鼻咽癌细胞的侵袭和迁移[6,7]。由于CDH11功能的差异性，在研究其对肿瘤发展过程中的影响时，需充分考虑细胞环境因素。由于CDH11在口腔鳞癌中的表达与功能尚不明确，所以本研究旨在通过选择性地对CDH11进行沉默，检测HNSCC行为及分子水平改变，进而揭示其在HNSCC中的功能，以期为研究HNSCC的发病机制并遏制其侵袭转移行为提供新思路。

1、材料和方法

1.1细胞来源

UM-SCC-29和UM-SCC-47头颈部鳞癌细胞系均由美国密歇根大学Carey教授馈赠；HOK16B永生化角质形成细胞由美国加州大学洛杉矶分校的Park博士馈赠。

1.2主要试剂

CDH11兔抗人单克隆抗体购自美国CST公司（编号：A16652),E-钙粘蛋白单克隆抗体购自美国BD公司（编号：610182),Twist-1单克隆抗体购自美国Proteintech公司（编号：25465-1-AP），肌动蛋白（Actin）单克隆抗体购自美国BD公司（编号：612656),RNAiMAX转染试剂购自美国Invitrogen公司，细胞裂解液购自美国CST公司，siRNA7和siRNA78均购自美国Dharmacon公司，BCA试剂盒购自沈阳万类生物公司。

1.3Western印迹法

应用细胞裂解液对细胞进行裂解，离心取得的上清液即为细胞总蛋白。应用BCA法测定样本蛋白浓度。应用Bio-Radmini4分析系统，应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）快速制胶试剂盒（上海雅酶生物科技公司）进行凝胶的制备，在蛋白质样品中加入蛋白上样缓冲液，100℃金属浴，冰上静置3min，上样量20μL，并加入5μL标志物，进行电泳。于电转液中进行转膜。应用含5%脱脂奶粉的封闭液慢摇1.5h。TBST缓冲液洗膜3次，倒入带抗体的封闭液，过夜。TBST缓冲液洗膜3次，倒入带有二抗的封闭液。TBST缓冲液洗膜3次，应用超敏增强化学发光试剂进行化学发光，并上机成像。

1.4转染

为了下调HNSCC细胞系中CDH11的表达，我们用小干扰RNA对细胞系进行转染。选取的空白对照组遵循如下序列：siNT:5′-GUGAUUUCAUAGCGAGUUU-3′；实验组选取了2种siRNA，分别遵循如下序列：siCDH11-7:5′-GGAAAUAGCGCCAAGUUAG-3′，siCDH11-8:5′-CCUUAUGACUCCAUUCAAA-3′。将HNSCC细胞接种在6孔板中，并使用RNAiMAX试剂盒转染siRNA。

1.5细胞增殖检测

细胞转染后24～48h，细胞以等密度接种（UM-SCC-29细胞：1×104个，UM-SCC-47细胞：2×104个）。用Countess全自动细胞计数仪（美国Invitrogen公司）在第1、3、5天对活细胞、非活细胞和总细胞进行定量。

1.6细胞侵袭实验

细胞转染后24～72h，将基质胶（美国BD公司）按1∶8稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37℃孵箱使基质胶聚合；制作细胞悬液，将200μL细胞悬液加入Transwell小室，培养细胞36h；取出Transwell小室，无钙磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline,PBS）清洗2遍，将未迁移细胞用甲醇固定，用0.1%结晶紫染色，PBS清洗3遍；400倍显微镜下随机选取5个视野观察细胞，计数。

1.7统计学分析

采用ImageJ软件对Western印迹法图像进行分析，采用GraphPadprism7.0软件对基因间的数据进行处理。统计学方法采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1Western印迹法

我们应用Western印迹法对多组HNSCC细胞系及非恶性永生化角质形成细胞（HOK16B细胞）进行检测。结果显示：CDH11在UM-SCC-29和UM-SCC-47细胞中表达高于在HOK-16B细胞中（图1A）。侵袭是HNSCC的一个重要特征，与上皮间充质转化和细胞间粘附丧失相关。由于CDH11在多种癌症中对侵袭、转移有不同的调节作用，我们研究了上皮间充质转化标志物的表达与CDH11的相关性[4,5,6,7,8]。应用Western印迹法对HNSCC细胞系及角质形成细胞中的上皮标志物（E-钙粘蛋白）和间充质标志物（Twist-1）进行检测，用肌动蛋白（Actin）做对照。结果显示，与HOK16B细胞相比，UM-SCC-29和UM-SCC-47细胞中E-钙粘蛋白的表达上调，而Twist-1的表达下调（图1B）。我们猜测高水平CDH11可能促进E-钙粘蛋白的表达，抑制Twist-1的表达。

图1CDH11及上皮和间充质转化标志物在HNSCC细胞及HOK16B细胞中的表达情况

2.2转染

我们选择了siRNA7、siRNA8，通过Western印迹法证实其对细胞内CDH11有下调作用（图2A、2B）。在降低CDH11表达后，检测上皮和间充质标志物以确定CDH11是否对其有负调节作用。结果显示：在UM-SCC-29细胞中，Twist-1与CDH11表达呈负相关，而与E-钙粘蛋白表达呈正相关（图2C）；在UM-SCC-47细胞中，E-钙粘蛋白与CDH11呈正相关，与Twist-1表达呈显著负相关（图2D）。重要的是，在HNSCC细胞中降低CDH11表达后，显微镜下可以观察到细胞间粘附降低（图3）。因此，CDH11的表达与上皮间充质转化呈负相关关系，其中包括上调上皮标志物（E-钙粘蛋白）及下调间充质标志物（Twist-1）。

图2CDH11被沉默后HNSCC细胞中上皮和间充质转化标志物表达变化情况

图3转染后HNSCC细胞形态的变化（×4)

2.3细胞增殖与侵袭实验

siRNA7、siRNA8诱导的2种细胞系（UM-SCC-29、UM-SCC-47）在72h时，增殖能力增强；在120h时，增殖能力显著增强（图4）。侵袭是一种促进肿瘤扩散的致癌行为。如图5A所示，转染36h时，分别经siRNA7、siRNA8沉默CDH11后，UM-SCC-29细胞侵袭能力均增强（siRNA7:P<0.001,siRNA8:P<0.05）;如图5B所示，UM-SCC-47细胞侵袭能力均增强（siRNA7:P<0.05,siRNA8:P<0.01）。这些发现与图2C、2D中的结果一致，证实了CDH11作为HNSCC中抑癌基因的作用。

图4HNSCC细胞转染后细胞增殖能力的变化

图5HNSCC细胞转染36h后细胞侵袭能力的变化

3、讨论

钙粘蛋白是一种跨膜糖蛋白，通过钙依赖性相互作用调节细胞间的亲和力[9]。钙粘蛋白含有一个带负电荷的结构域，它可以与Ca2+结合，而钙粘蛋白家族成员间的细胞质结构域有所差异[3]。钙粘蛋白超家族成员超过80个，而CDH11是钙粘蛋白超家族经典亚类的成员[3,9]。Ⅰ型经典钙粘蛋白包括：E-钙粘蛋白/钙粘蛋白1,N-钙粘蛋白/钙粘蛋白2,P-钙粘蛋白/钙粘蛋白3,R-钙粘蛋白/钙粘蛋白4,CDH11属于Ⅱ型经典钙粘蛋白[9]。其他钙粘蛋白包括原生钙粘蛋白、桥粒钙粘蛋白、七通道跨膜钙粘蛋白和Ret酪氨酸激酶[9]。经典的钙粘蛋白调节细胞间的相互作用、组织稳态和组织形态的形成。一个细胞上的钙粘蛋白同型二聚体与另一个细胞上的同型二聚体结合形成转二聚体，促进细胞间的粘附。鉴于这些重要作用，钙粘蛋白的破坏会引起细胞正常功能的失调，进而引发疾病的产生[10]。

CDH11基因位于16号染色体上[11]，其与成骨细胞分化相关，促进软骨成骨，抑制脂肪生成[3,9]。CDH11可以促进前列腺癌细胞的侵袭和骨转移，在结直肠肿瘤中表达上调[5,8,12]。但Mueller等[13]发现黑色素瘤组织中CDH11的表达缺失。Marchong等[6]发现CDH11在视网膜母细胞瘤中发生基因组缺失，且其缺失与肿瘤侵袭能力增加有关。在视网膜母细胞瘤和恶性嗜铬细胞瘤中的研究表明，CDH11具有抑制肿瘤转移的作用[6,14]。此外，CDH11的表达升高一定程度上降低了肺癌的转移潜能，并在骨肉瘤中成为了一种提示预后较好的预测因子[15]。有关CDH11与肿瘤关系的研究目前仍存在争议，不同类型癌症的CDH11致癌或抑癌功能也不尽相同。本研究中，Western印迹法的结果显示，上皮标志物（E-钙粘蛋白）表达水平较高，而间充质标志物（Twist-1）表达水平较低的HNSCC细胞系，其CDH11的表达水平较正常细胞有所提高，即与正常角质细胞相比，在上皮间充质转化过程尚未发生或在上皮间充质转化水平较低的HNSCC细胞中，CDH11呈现较高的表达水平。在功能研究中，我们发现降低CDH11的表达后，HNSCC细胞上皮标志物（E-钙粘蛋白）的表达降低，而间充质标志物（Twist-1）的表达升高，且出现了细胞间粘附能力降低、增殖能力增强、侵袭能力加强的表现，这充分说明了CDH11在HNSCC细胞中具有抑制肿瘤细胞上皮间充质转化过程的作用。虽然在本研究中，CDH11的表达水平升高，但其对HNSCC细胞系的功能影响与Mueller等[13]、Marchong等[6]的研究结果相一致。

综上所述，不同种类HNSCC细胞系的组织来源各异，如此前提到，对CDH11的研究应考虑肿瘤细胞的来源。本实验中的CDH11虽在UM-SCC-29、UM-SCC-47细胞中总体呈现高表达的趋势，但其在其他来源HNSCC细胞系的表达情况需进一步研究。CDH11在调控肿瘤细胞的过程中，可能对多种不同的信号通路均有影响。近期的研究表明，CDH11通过调节β-连环蛋白（β-catenin）来调节经典WNT信号通路[16]，这为我们发掘CDH11调控肿瘤尤其是HNSCC的机制，提供了有力依据。为了更好地利用CDH11在肿瘤发生、发展过程中的作用，促进肿瘤生物治疗的发展，有关CDH11在HNSCC中发生、发展的分子机制有待进一步研究。

沈禹辰,刘苗苗,李建豪,夏燕云,李吉辰,朴松林.钙粘蛋白11在头颈部鳞癌中相关作用的研究[J].口腔颌面外科杂志,2020,30(04):211-215.