首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 医学职称论文 > 医学职称论文范文 > 未羧化骨钙素对老年大鼠睾丸间质细胞睾酮合成功能的影响

未羧化骨钙素对老年大鼠睾丸间质细胞睾酮合成功能的影响

2020-10-07 199 上传者：管理员

摘要：目的:通过建立老年大鼠模型,探究未羧化骨钙素对老年雄性大鼠睾丸间质细胞睾酮合成的影响。方法:30只3月龄成年雄性大鼠,随机对半分为正常对照组和实验组,实验组颈背部皮下注射D-半乳糖溶液300mg•kg-1•d-1,对照组颈背部皮下注射等剂量生理盐水,注射时间为8周。验证衰老模型构建成功后,取大鼠的睾丸间质细胞,分别用不同质量浓度0(等量PBS溶液)、1、3ng/mL的非羧化骨钙素刺激大鼠睾丸间质细胞,24h后收取培养液采用睾酮ELISA检测试剂盒进行睾酮浓度检测;并在24h后收集细胞提取RNA,然后采用荧光定量PCR法检测睾丸间质细胞睾酮合成关键酶StAR、Cyp11a、Cyp17的表达。结果:同加入等量PBS溶液的对照组大鼠睾丸间质细胞相比,加入等量PBS溶液的模型组大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮水平下降(P<0.05);对模型组大鼠睾丸间质细胞分别进行1、3ng/mL未羧化骨钙素处理,相较于模型组加入等量PBS溶液处理的睾丸间质细胞,骨钙素处理组睾丸间质细胞培养液上清中睾酮水平均升高(P<0.05);与加入等量PBS溶液的模型组大鼠睾丸间质细胞相比,经过1ng/mL未羧化骨钙素处理后的模型组大鼠睾丸间质细胞的StAR、Cyp11a、Cyp17基因的表达有明显的上升;经过3ng/mL未羧化骨钙素处理后的模型组大鼠睾丸间质细胞的StAR、Cyp11a、Cyp17基因的表达有显著上升。结论:本研究成功的构建了D-半乳糖诱导的衰老大鼠模型,证明了未羧化的骨钙素可以促进D-半乳糖诱导的老年大鼠睾丸间质细胞睾酮合成,并且该作用可能是由于未羧化骨钙素促进其睾酮合成关键酶的表达引起的。

关键词：
未羧化骨钙素
睾丸间质细胞
睾酮
老年
加入收藏

当前社会老龄化问题日益严重,有关老年男性雄激素缺乏的问题逐渐成为引人注目的焦点,男性迟发性性腺功能减退症是指中老年男性随年龄增大,血清睾酮水平进行性下降而出现的一组临床综合征[1]。根据欧洲衰老研究组织(EMAS)报告显示,人群中LOH的总体患病率为2.1%,并且随着年龄的增长患病率也随之上涨,40～49岁的男性患病率为0.1%,在50～59岁的男性当中上升到0.6%,在60～69岁男性患病率上升为3.2%,在70～79岁男性患病率则为5.1%[2]。睾酮分泌减少是LOH极为重要的特征之一,同时也是LOH诊断的必要条件。最近的研究表明,存在与下丘脑-垂体-性腺轴平行的内分泌通路,该通路能够作用于睾丸的内分泌功能,其中涉及骨源性激素骨钙素[3]。

骨钙素(osteocalcin,OC)是成骨细胞分化成熟后特异表达的标志蛋白,被视为骨更新和骨转化的标志物[4]。骨钙素在人体内有羧化完全的骨钙素(cOC)和未羧化的骨钙素(ucOC)两种表达形式。完全羧化的骨钙素在骨代谢中起到重要作用,能够帮助其与羟基磷灰石的结合,保持骨骼的正常矿化。未羧化的骨钙素被释放在血液中,具有生物学活性[5,6]。研究证明,未羧化的骨钙素与男性生殖密切相关,骨骼可以通过未羧化骨钙素调节睾丸间质细胞的功能,并通过睾酮水平的变化影响睾丸的生精功能[7]。

本研究通过D-半乳糖溶液皮下注射构建雄性大鼠的衰老模型,研究未羧化骨钙素对老年雄性大鼠睾酮合成功能的影响,希望为临床上利用骨钙素治疗男性迟发性性腺功能减退症提供研究基础。

1、材料与方法

1.1实验动物

从河南省实验动物中心购买3月龄SPF级SD雄性大鼠30只,体重为(220±30)g。饲养条件:所有大鼠均饲养于独立的通风鼠笼中,室温恒定为26℃,自由饮食水。

1.2药物与试剂

未羧化骨钙素,购于Kamiyabiomedical公司;D-半乳糖、Percoll分离液、胎牛血清,购于北京索莱宝科技有限公司。DMEM/F12培养液购于Hyclone公司。StAR、Cyp11a(P450-scc)、Cyp17(p450-c17)引物的合成由郑州擎科生物技术服务有限公司合成。

1.3实验方法

实验分组与模型建立:喂养7d使大鼠适应环境后,30只雄性大鼠采用随机分组的方法分为2组,对照组、模型组各15只,模型组大鼠在颈背部皮下注射D-半乳糖300mg·kg-1·d-1,对照组大鼠每日皮下注射等体积的生理盐水,造模时间为8周。

模型的观察指标及方法8周后随机从每组中挑选3只大鼠采用颈椎脱臼法处死大鼠,采集血浆及睾丸组织,衰老建模成功与否由大鼠血清睾酮水平,脏器系数,睾丸组织氧化应激指标及睾丸切片结果共同判断。

大鼠睾丸间质细胞的提取与鉴定:大鼠采用颈椎脱臼法处死后浸入75%乙醇中消毒3～5min,用无菌剪刀在冰面上去除睾丸的白膜,将睾丸实质拨散后,将实质加入装有Ⅳ型胶原酶消化液的离心管中,用封口膜将管口密闭,将离心管放入37℃水浴锅内消化30min,消化期间每隔5min摇晃试管1min,待睾丸实质几乎全部散开之后加入2倍体积的含有10%FBS的培养液终止消化,将试管内的溶液用200目的筛网过滤,过滤掉剩余未消化的实质。过滤后的液体在离心机内1500r/min离心8min,将上清液弃掉后用适量DMEM培养基重悬细胞,将悬液加于由下向上分别为60%、34%、26%、21%浓度的Percoll分离液的顶层,3000r/min离心25min。取60%和34%浓度之间第3条细胞带的悬液,Hanks液稀释,离心机离心2次,每次1000r/min离心5min,将细胞沉淀加入含10%FBS的培养液,最后将细胞培养板放于5%二氧化碳培养箱中。睾丸间质细胞的染色鉴定方法为3β-HSD染色。在细胞培养液内加入配置好的3β-HSD溶液约100μL,放置在37℃温箱内5h后再在光学显微镜下观察结果。如果观察到被染成蓝紫色的细胞,则证明提取培养的原代细胞为实验所需的Leydig细胞。

ELISA检测睾丸间质细胞分泌的睾酮浓度:用光学显微镜每天观察细胞的生长状况,待观察到8成以上细胞铺细胞培养板时进行传代,选择使用第二代细胞作为实验使用。分别用不同质量浓度0(等量PBS)、1、3ng/mL的ucOC刺激Leydig细胞,每组各3孔细胞,24h后将收集上清培养液采用ELISA试剂盒检测睾酮浓度。

荧光定量PCR检测未羧化骨钙素培养后衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮合成关键酶表达情况:分别用不同质量浓度0(等量PBS)、1、3ng/mL的ucOC刺激Leydig细胞,每组各三孔细胞,用Trizol提取睾丸间质细胞的RNA,测定RNA的纯度后按照反转录试剂盒得到cDNA作为模板,使用荧光定量PCR的方法检测衰老模型组大鼠睾丸间质细胞StAR、Cyp11a(P450-scc)、Cyp17(p450-c17)等睾酮合成关键酶的表达。引物序列见表1。

表1引物序列

1.4统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行数据处理。计量资料用x±s表示,比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。qRT-PCR的结果利用2-△△Ct法计算,数据图表采用Graphpadprism8.0制作处理。

2、结果

2.1大鼠亚急性衰老模型的验证

2.1.1大鼠一般情况及睾酮水平的变化

在注射D-半乳糖溶液8周后,发现模型组大鼠饮食明显减少,身型萎缩,行动迟缓,反应变慢。我们从衰老模型组大鼠和正常对照组大鼠随机各取3只处死,检查其睾丸指数,睾酮水平。模型组与对照组比较,睾丸指数下降(睾丸重量/体重)下降(P<0.05),见表2。血清睾酮水平降低(P<0.05),见图1。

表2大鼠的一般情况

2.1.2大鼠氧化应激指标的测定

用脱颈法处死大鼠,取部分睾丸组织,按照试剂盒操作流程检测睾丸组织中SOD酶活性与MDA水平。根据图2发现与对照组比较,模型组衰老大鼠SOD的含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),MDA水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1大鼠血清睾酮水平

图2大鼠氧化应激指标测定

2.1.3大鼠睾丸结构的测定

从苏木精-伊红染色中可看出,对照组大鼠睾丸组织的结构完整,生精小管饱满,生精细胞数量相对较多且排列整齐,管内精子含量相对较高,间质细胞数量相对较多。模型组大鼠睾丸组织的结构混乱,生精小管上皮损伤、萎缩,生精细胞数量相对较少且排列无规律;管内精子数目减少,间质细胞少见。见图3。

2.2大鼠睾丸间质细胞的提取和验证

提取后的原代睾丸间质细胞在培养基中培育12h后,绝大多数细胞开始贴壁生长,此时睾丸间质细胞成团分布,大多呈现为圆形或者纺锤形,48h后传代的睾丸间质细胞将会从胞体内生出触角(图4)。对培养了48h的睾丸间质细胞进行3β-HSD染色,阳性细胞胞质内存在大量蓝色物质(图5)。

2.3未羧化骨钙素对衰老大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮水平的影响

对照组和模型组睾丸间质细胞在加入等量PBS后细胞上清中的睾酮含量为(0.315±0.011)ng/mL和(0.119±0.012)ng/mL。同加入等量PBS溶液的对照组大鼠睾丸间质细胞相比,加入等量PBS溶液的模型组大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮水平下降(P<0.05);对模型组大鼠睾丸间质细胞分别进行1、3ng/mL未羧化骨钙素处理,相较于模型组加入等量PBS溶液处理的睾丸间质细胞,骨钙素处理组细胞分泌的睾酮水平均升高分别为(0.257±0.017)ng/mL、(0.215±0.026)ng/mL(P<0.05),但仍低于对照组大鼠睾丸间质细胞睾酮水平(P<0.05),见图6。

图3大鼠睾丸组织苏木精-伊红染色

图4睾丸间质细胞原代及传代培养(×100)

图5睾丸间质细胞染色鉴定

图6不同浓度的ucOC对睾丸间质细胞睾酮合成的影响(n=3)

2.4未羧化骨钙素对衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮合成关键酶表达的影响

将提取的模型组大鼠睾丸间质细胞加入不同浓度的未羧化骨钙素溶液培养24h后,提取RNA,利用RT-PCR检测睾酮合成酶的表达情况。实验结果显示,与加入等量PBS溶液的模型组大鼠睾丸间质细胞比较,经过1ng/mL未羧化骨钙素处理后的模型组大鼠睾丸间质细胞的StAR、Cyp11a、Cyp17基因的表达有明显的上升;经过3ng/mL未羧化骨钙素处理后的模型组大鼠睾丸间质细胞的StAR、Cyp11a、Cyp17基因的表达有显著上升,见图7;说明外源性加入的未羧化骨钙素可以促使模型组衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮合成关键酶表达上升,并且在一定程度上可能和剂量浓度具有相关性。

3、讨论

目前认为睾酮水平下降是出现LOH症状的主要原因,但其发病机制并未完全阐明。睾丸是合成睾酮的主要器官,睾丸间质细胞分布于睾丸曲细精管间,大约95%以上的睾酮是由睾丸间质细胞合成[8]。有研究者认为LOH的发病机制可能与睾丸间质细胞功能减退及昼夜节律变化为特征的下丘脑-垂体-性腺轴功能减退有密切关系[9]。

图7qPCR检测不同浓度的ucOC对衰老大鼠睾丸间质细胞睾酮合成关键酶的影响

D-半乳糖致衰老模型的建立是通过在一段时间内连续给动物(多为SD大鼠)注射一定剂量的D-半乳糖,乳糖的积聚将使细胞通透性改变,影响细胞正常发挥其应有的作用,接着产生的超出机体所能承受范围之外的活性氧使各个器官抗氧化能力下降,最终多器官衰退造成衰老,这一过程和自然衰老的病理过程有一定的相似性[10,11]。该模型可造成机体神经衰老、心脏老化、免疫功能退化、肝脏功能退化、生殖功能退化等[12]。且有研究证实该模型可以用来模拟老年性腺损伤,活性氧(ROS)在睾丸间质细胞的积聚将导致细胞合成类固醇的下降,从而进一步导致睾酮水平降低[13]。本次实验选择了雄性SD大鼠,在颈背部皮下注射D-半乳糖溶液300mg·kg-1·d-1,持续注射8周后构建衰老模型,在实验过程中有2只大鼠死亡,其中1只为皮下注射过程中意外损伤,另一只死亡原因不详,剩余大鼠正常存活。8周后发现注射D-半乳糖溶液的模型组大鼠和正常对照组相比,模型组大鼠摄食量明显减少,身型萎缩,行动迟缓,精神萎靡,血清睾酮水平降低,睾丸指数下降,氧化应激水平改变(SOD降低,MDA升高),睾丸间质细胞的细胞形态也发生明显变化,实验结果与既往研究结论类似,证实模型构建成功[14,15,16]。

近年来,骨钙素除了认为是骨代谢及骨重建过程中的代谢标记物,关于骨钙素对男性生殖系统的影响逐渐被越来越多的学者发现和重视[7]。Oury等[17]早期研究中发现在体外培养的睾丸间质细胞中添加野生型小鼠成骨细胞培养液上清可促进其分泌睾酮,认为非羧化骨钙素作为成骨细胞特异性分泌的蛋白,具有促进雄性性腺发育的功能。我们对体外培养的睾丸间质细胞培养液进行检测发现模型组大鼠跟对照组相比,睾丸间质细胞睾酮分泌能力显著下降。对于模型组大鼠,加入不同浓度的未羧化骨钙素组同加入等量PBS溶液的空白组比较,加入1、3ng/mL未羧化骨钙素的睾丸间质细胞合成睾酮浓度得到较为明显的上升。以上结果表明,衰老模型组睾丸间质细胞睾酮合成能力较对照组下降显著,经未羧化骨钙素处理后可明显提高其睾酮合成能力。但值得注意的是,高浓度的未羧化骨钙素可能导致这种刺激作用减弱。

睾丸间质细胞的睾酮合成收到多种酶的调节,其中,StAR、Cyp11a、Cyp17三者作为标志物在研究中常用于判定细胞睾酮合成的能力[18]。为了研究外源性非羧化骨钙素对衰老大鼠睾丸间质细胞的影响,本研究分别合成了StAR、Cyp11a、Cyp17三种睾酮合成关键酶的引物,通过荧光定量PCR检测睾丸间质细胞中标识性酶分子的表达,发现加入非羧化骨钙素后,大鼠睾丸间质细胞StAR、Cyp11a、Cyp17主要的相关睾酮合成关键酶的表达水平都有所提高,这证明了非羧化骨钙素能够促进亚急性衰老模型大鼠睾酮合成关键酶的表达,但其更为详细的机制仍需进一步研究,并且这种调控在男性迟发性性腺功能减退患者体内是否具有相同的效应也有待验证,如果通过分子生物学方面的研究最终揭开未羧化骨钙素的作用过程,也许会对临床研究中利用未羧化骨钙素治疗LOH患者起到重要的作用。

本实验建立并验证了D-半乳糖大鼠衰老模型,研究了ucOC对老年雄性大鼠睾丸间质细胞睾酮合成功能的调控,为临床上利用ucOC治疗LOH提供研究基础。实验证实,未羧化的骨钙素可以促进D-半乳糖诱导的老年大鼠睾丸间质细胞睾酮合成,并且该作用可能是由于未羧化骨钙素促进其睾酮合成关键酶的表达引起的。

于骐玮,崔趁趁,冯科,夏彦清,万锋,郭海彬.未羧化骨钙素对老年大鼠睾丸间质细胞睾酮合成功能的影响[J].临床泌尿外科杂志,2020,35(10):785-790.