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甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌携带耐药及耐消毒剂基因的调查
摘要：目的了解甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地内分离的鼠疫菌携带耐消毒剂及耐药相关基因的状况,为指导该疫源地在今后的鼠疫防治工作中合理使用抗菌药物和消毒剂提供参考依据。方法利用常规的十二烷基硫酸钠(SDS)裂解,酚-氯仿抽提方法对甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地境内分离的49株鼠疫菌进行DNA染色体的提取,DNA终浓度稀释至0.002μg/μl,并对耐氨基糖苷类链霉素基因(strA、strB)、耐β-内酰胺类药物相关基因(tem、ctx-m),耐磺胺类药物相关基因(sul1、sul2)及耐季铵盐类消毒剂基因(qacEΔ1-sul1)7对引物按设定的PCR反应体系逐一进行PCR扩增,同时设阳性对照和空白对照。结果通过PCR扩增在49株鼠疫菌中未检测出耐氨基糖苷类链霉素基因(strA、strB)、耐β-内酰胺类药物相关基因(tem、ctx-m),耐磺胺类药物相关基因(sul1、sul2)及耐季铵盐类消毒剂基因(qacEΔ1-sul1)。结论甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地分离的49株鼠疫菌不具有耐消毒剂及耐药相关基因的特征。
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甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地位于我国黄土高原的西北边缘区，分布于甘肃省会宁、靖远及宁夏海原、西吉、固原5个县，疫源地面积约28.60万公顷。该疫源地于1962年发生一起人间肺鼠疫疫情，从人尸和自毙沙狐体内分离出鼠疫菌。1963年又从阿拉善黄鼠及其寄生蚤(方形黄鼠蚤蒙古亚种)体内分离出鼠疫菌后，证实了该疫源地的存在[1]。该疫源地自1963年后出现过两次动物间鼠疫流行高峰，一次散发流行，但未发生过人间鼠疫疫情。研究发现[2,3],该疫源地自1991年后再未检出鼠疫菌，已多年未发生过鼠间和人间鼠疫疫情，鼠疫疫情处于静息状态。但与该自然疫源地相邻近的甘肃省境内河西走廊区域，动物间鼠疫疫情经常发生，动物血清中不断检测出阳性结果，随着交通的便利，极易引起鼠疫疫情的传播流行[3,4,5]。本研究对甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地分离的49株鼠疫菌进行耐药及耐消毒剂基因的检测，试图了解该疫源地鼠疫菌携带耐药及耐消毒剂基因的状况，以便为该地区的鼠疫防控策略提供科学依据和理论支持。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌株
被试菌株为1962—1991年分离自甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地内的鼠疫杆菌，共49株，由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。不同耐药基因的阳性模板DNA(A1234)由中国疾控中心馈赠。
1.1.2引物设计
参照美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公布的sul1、sul2、strA、strB、tem、ctx-m、qacEΔ1-sul1共7种基因序列分别设计引物，并依托生工生物工程(上海)股份有限公司合成其引物。见表1。
1.1.3主要试剂和仪器
TaqDNAMIX、dNTPs、DL-2000Marker、琼脂糖均购自北京欣经科生物技术有限公司。PCR扩增仪(德国艾本德公司);DYY-12型电泳仪(北京六一仪器厂);核酸蛋白测定仪(英国通用电气);GBOX-F3凝胶成像系统(英国SYNGENE公司)。
1.2方法
1.2.1鼠疫菌DNA的提取
鼠疫菌染色体DNA的提取按照常规十二烷基硫酸钠裂解及酚-氯仿抽提方法进行[6]。利用超微量核酸蛋白测定仪测定DNA含量，并将DNA终浓度稀释至0.002μg/μl。
1.2.2PCR扩增
参照文献[7],以鼠疫菌DNA为模板，应用7对引物逐一进行扩增，设阳性对照和阴性对照。PCR反应体系：10×Buffer5.0μ1,10mmol/L,dNTP0.2μ1,5U/μ1Taq,DNA聚合酶0.5μ1,2μmol/L引物对1.0μ1,模板DNA(0.002μg/μ1)5.0μ1,用去离子水补足至25.0μ1。PCR扩增条件：95℃预变性4min;95℃变性40s,56℃退火40s,72℃延伸40s,30个循环；72℃终延伸4min。因tem基因引物的产物较长，延伸时间延长为70s,其他条件不变。取PCR产物7.5μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，电压为80～100V,电泳15～30min,结束后将胶置于凝胶成像系统拍照并记录。
2、结果
2.1PCR扩增结果
为避免PCR扩增结果出现非特异性，对其引物设立了阴性和阳性对照，琼脂糖凝胶电泳时与相对分子质量单位(Mr)的标志物DNA2000Marker同时电泳，结果显示被测鼠疫菌株DNA扩增产物在预计的Mr处均未出现阳性条带，阴性对照和阳性对照均成立。以磺胺类耐药相关基因(sul2)引物为例显示该疫源地部分菌株的PCR扩增结果，图中1～22表示部分鼠疫菌株的扩增结果，其余菌株均按上述方法进行检测，结果均为阴性。见图1。
2.2甘宁黄土高原鼠疫疫源地内不同地区鼠疫菌耐药基因及耐消毒剂基因检测结果
甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地内分离的49株鼠疫菌，其中会宁县15株、靖远县3株、海源县27株、西吉县2株、固源县2株，均未检出携带磺胺类(sul1、sul2)耐药相关基因、氨基糖苷类链霉素(strA、strB)耐药相关基因、β-内酰胺类(tem、ctx-m)耐药相关基因及耐季铵盐类消毒剂(qacEΔ1-sul1)基因。
3、讨论
抗生素在细菌性疾病的预防和治疗中有着举足轻重的作用，随着抗生素的广泛使用，其耐药性已经成为一个危害公共健康的全球性问题[8]。细菌的耐药不仅会改变药物作用的靶位点或降低细菌对药物的敏感性，而且可以在不同菌株间通过质粒或染色体的介导引起流行性感染[9],从而给细菌性疾病的预防和治疗带来新的挑战。目前，细菌的耐药现象早已从抗生素扩展到了消毒剂，并随着消毒剂的广泛使用，其抗性问题日趋严重[10]。研究表明，细菌通过获得携带qac家族基因的质粒来产生消毒剂抗性[11]。Stokes在1989年首次提出了与细菌耐药传播相关的基因系统—整合子的概念[12],整合子的基本结构由1个编码整合酶的intI1基因、2个基因重组位点attI和attC、启动子和耐药基因盒组成。整合子的类型由整合子中的整合酶基因序列的不同而分类，已发现的6类整合子耐药机制中，I类整合子最常见并起着非常重要的作用[13],其结构中的5′-保守端有编码整合酶的intI1基因及启动子，大多数3′-保守端有3个开放读码框(ORF):季铵盐类耐药基因(qacE△1),磺胺耐药基因(sul1),功能不明的ORF5。其中耐消毒剂基因qacE△1是I类整合子的一部分，编码的是一种跨膜蛋白，位于I类整合子的保守序列，该产物对季铵盐类消毒剂能产生耐药[14],可被革兰阳性和革兰阴性菌广为获取；sul1位于Ⅰ类整合子3′端的保守序列上[15],编码的是对磺胺类药物具有抗性的二氢叶酸合成酶，阳性提示细菌对磺胺类药物耐受。由于qacEΔ1和sul1基因相连，设计的引物横跨qacEΔ1和sul1,故称做qacEΔ1-sul1[16]。整合子是继转座子之后新发现的可移动基因元件，不仅可携带多种β内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶基因，而且更易在同种细菌和不同种类细菌中进行基因的水平转移，使细菌的耐药性得以快速传播[17]。
迄今为止，以链霉素为代表的抗生素在鼠疫患者的临床治疗上取得了较好的疗效，但是国外陆续报道耐药鼠疫菌[18,19]。1995年，从马达加斯加分离出一株名为17/95的鼠疫菌，对8种抗菌药物(链霉素、氯霉素、四环素、磺胺类药物、氨苄西林、卡那霉素、壮观霉素和米诺环素)表现出多药耐药特征[18]。同年在马达加斯的一株名为16/95的鼠疫菌仅对链霉素有耐药性[19]。通过结合质粒(pIP1202,鼠疫菌16/95株[18])或自转移质粒(pIP1203,鼠疫菌16/95株[19])获得对抗生素的抗性。国内其他研究尚未发现鼠疫耐药及耐消毒剂菌株[20,21]。鼠疫菌是生物恐怖制剂之一，令人担扰的是用耐药鼠疫菌或耐消毒剂鼠疫菌做为生物恐怖袭击的武器，其控制的难度将增大。因此，开展鼠疫菌对消毒剂及抗菌药物的抗性监测，对防控消毒剂与抗生素耐药性与基因传播有着重要作用。
本研究通过对甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地内分离的49株鼠疫菌进行磺胺类(sul1、sul2)耐药相关基因、耐链霉素(strA、strB)耐药相关基因、β-内酰胺类(tem、ctx-m)耐药相关基因及耐季铵盐类消毒剂(qacEΔ1-sul1)基因检测，结果尚未检出携带上述耐药基因及耐消毒剂基因的鼠疫菌株。目前，该疫源地1962—1991年分离菌株虽未发现鼠疫耐药菌株，但随着鼠疫菌抗菌药物的不断发展和应用，其单纯耐药和多重耐药现象仍可能出现，同时耐消毒剂和耐药作用的交互效应也不容忽视。因此，该地区今后应将耐药及耐消毒剂鼠疫菌株的检测纳入鼠疫防控的常规工作中，以便为鼠疫临床用药提供参考，同时为该地区制定精细化的鼠疫防控手段提供有效的科学依据。
利益冲突无
参考文献：
[1]安君胜.2010年甘宁阿拉善黄鼠鼠疫监测结果分析[J].疾病预防控制通报，2011,26(1):47-48.
[2]李晓芳，王升文，吴丽文，等.2013年甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地鼠疫监测分析[J].疾病预防控制通报，2014,29(6):22-24.
[3]安君胜，李旭娟，段文科，等.甘肃省鼠疫流行分析[J].疾病预防控制通报，2019,34(6):36-38,61.
[4]展东辉.2012年甘肃省肃南县鼠疫监测结果分析[J].疾病预防控制通报，2013,28(2):47-48.
文章来源：辛有全,李胜,何建,杨晓艳,靳娟,张琪,代瑞霞,李广辉,魏柏青,张青雯.甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌携带耐药及耐消毒剂基因的调查[J].医学动物防制,2021,37(10):936-938+942.
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