首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 耳鼻咽喉科论文 > 中耳炎论文 > 中性粒细胞诱捕网在儿童分泌性中耳炎中的机制研究

中性粒细胞诱捕网在儿童分泌性中耳炎中的机制研究

2024-12-10 55 上传者：管理员

摘要：目的通过研究中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)及相关因子在分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)患者中耳渗液中随病程的变化，探讨NETs在OME中的病理机制。方法纳入2021年1月至2021年12月兰州大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科收治的行鼓膜穿刺或鼓室切开置管OME患者30例(40耳)，伴腺样体肥大27例，伴鼻窦炎11例。根据病程分为短病程组(<3月)14耳、中病程组(3～6月)8耳，长病程组(>6月)18耳。通过免疫荧光、Pico Green DNA试剂盒测定DNA含量、Western Blot等方法对各组中耳积液中中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、游离DNA、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)及黏蛋白5B(mucin 5B,MUC5B)进行定性及定量分析。结果 OME患者中耳积液中NE、MPO与游离DNA共定位，形成网状结构。中耳积液中游离DNA、NE、MPO、IL-8和MUC5B的含量随病程延长而增加，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。MPO与NE表达呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05),MPO、NE与IL-8表达呈正相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NETs参与慢性OME的病理过程，含量水平受IL-8调控，其水平随病程延长而增加。OME患者中耳积液中MUC5B水平随病程延长而增多。

关键词：
OME
中性粒细胞胞外诱捕网
分泌性中耳炎
白细胞介素-8
黏蛋白5B
加入收藏

分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)是以听力减退及鼓室积液为主要特征的中耳非化脓性炎症。30%～40%学龄前儿童具有多次OME发作史，是儿童听力损失常见原因之一[1-2]。病程持续3个月以上的OME可发展为慢性OME。

O M E发病机制尚不完全明确。研究表明，中性粒细胞介导的炎症反应可能以中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)方式参与了慢性OME疾病进程。NETs是由中性粒细胞活化后在胞外形成的网状纤维结构，由游离脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、组蛋白等多种蛋白构成，既能直接杀死病原体，也参与了多种炎症性疾病[3-4]。Val S等[5]研究发现，白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是OME积液中高水平炎症因子，黏蛋白5B(mucin5B,MUC5B)是主要黏蛋白成分。既往研究在OME患者或动物模型中大多只检测了单种NETs组分蛋白的含量，未检测其含量随病程的变化情况，缺乏NETs与IL-8及黏蛋白等的相关性分析。文章利用多个标记蛋白对不同病程OME患者中耳积液中NETs进行定量分析，同时检测IL-8等水平，探究NETs随病程变化及其与IL-8、黏蛋白相关的调控机制。

所有作者均声明不存在利益冲突

1、资料与方法

1.1研究对象

回顾性纳入2021年1月至2021年12月兰州大学第一临床医学院耳鼻咽喉头颈外科收治的行鼓膜穿刺或鼓室切开置管OME患者30例(40耳)，伴腺样体肥大27例，伴鼻窦炎11例。根据病程分为短病程组(<3月)11例(14耳)、中病程组(3～6月)6例(8耳)，长病程组(>6月)13例(18耳)。短病程组男性6例(8耳)，女性5例(6耳)，年龄4～7岁，平均年龄(5.00±1.31)岁；中病程组男性2例(2耳)，女性4例(6耳)，年龄4～8岁，平均年龄(5.33±1.37)岁；长病程组男性8例(11耳)，女性5例(7耳)，4～13岁，平均年龄(6.00±3.22)岁。纳入标准：(1)年龄3～13岁；(2)声导抗图检查为“B”“C”型曲线，且耳内镜检查发现鼓室积液；(3)药物治疗，如抗生素、鼻用减充血剂、糖皮质激素、黏液促排剂等1个月无明显改善。排除标准：(1)过敏性鼻炎；(2)不动纤毛综合征；(3)颌面部发育异常；(4)智力发育受限。本研究经兰州大学第一临床医学院医学伦理委员会审批(LDYYLL2022-314)，患儿家属对研究知情同意。

1.2方法

药物治疗1个月无明显改善者行腺样体切除术时同时行鼓膜穿刺；药物治疗3个月以上无改善者行鼓膜切开置管术。手术中清洁消毒外耳道后，切开鼓膜。将耳科吸引管和2 m L注射器针筒依次连接到吸引器，自鼓膜切开处收集鼓室积液，-80℃冻存备用。

中耳积液涂片后免疫荧光抗体标记，激光共聚焦显微镜(蔡司，LSM880)下观察中耳积液中的DNA(440 nm)、NE(488 nm)、MPO(594 nm)和MUC5B(5 9 4 n m)结构。M P O单克隆抗体(S a n t a C r u z biotechnology,SC-52707),DAPI(北京索莱宝生物科技有限公司，C0065),NE单克隆抗体(Abcam,ab131260),MUC5B(Santa Cruz biotechnology,SC-21768)。

利用Pico Green DNA测定试剂盒(Thermo Scientific,p11496)及酶标仪(520 nm处)检测短病程组6例(8耳)、中病程组4例(6耳)、长病程组6例(8耳)中耳渗液游离DNA浓度。利用Western Blot方法检测各组NE、MPO、IL-8含量，选择GAPDH作为内参蛋白。琼脂糖凝胶法检测MUC5B含量。GAPDH单克隆抗体(Santa Cruz biotechnology,SC-47724),NE单克隆抗体(Abcam,ab131260),MPO单克隆抗体(Santa Cruz biotechnology,SC-52707),IL-8单克隆抗体(Santa Cruz biotechnology,SC-376750),MUC5B单克隆抗体(Santa Cruz biotechnology,SC-21768)。利用凝胶成像系统采集图像并保存，扫描后使用Image J软件分析每个孔的灰度值，标准化后，统计结果。对MPO、NE、IL-8等的含量进行相关性分析。

1.3统计学方法

采用Graph Pad 8.0.2和SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料采用表示，多组间使用温室Geisser校正后使用单向方差检验，两组间比较用LSD检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组免疫荧光染色结果

各组中耳积液中均存在游离DNA、NE、MPO和MUC5B，且NE、MPO和DNA共定位。中病程组DNA、NE、MPO、MUC5B荧光强度强于短病程组，长病程组DNA、NE、MPO、MUC5B荧光强度强于中病程组(图1)。

2.2各组中耳积液中游离DNA含量

长病程组中耳积液游离DNA高于中病程组、短病程组，差异均有统计学意义(P<0.01)，中病程组中耳积液游离DNA高于短病程组，差异有统计学意义(P<0.001，表1)。

2.3各组中耳积液中蛋白含量比较

NE、MPO、IL-8含量随病程延长呈升高趋势(图2 (1))：长病程组MPO相对含量、NE相对含量、IL-8相对含量、MUC5B相对含量均高于短病程组、中病程组，差异均有统计学意义(P<0.05，图2(2)、图2(3)、图2(4))。

图1 OME患者中耳积液免疫荧光图像

(1)使用DAPI对DNA进行染色，特异性抗体标记NE、MPO，比例尺：50μm;(2)使用DAPI对DNA进行染色，特异性抗体标记NE、MUC5B，比例尺：50μm

表1 OME患者中耳积液游离DNA含量比较

图2 各组中耳积液中蛋白含量

(1)OME患者中耳积液MPO、NE、IL-8的Western Blot结果(以GAPDH含量为参照)；(2)各组MPO、NE、IL-8相对含量；(3)OME患者中耳积液MUC5B琼脂糖凝胶电泳结果(以短病程组样本中MUC5B含量均值为参照)；(4)各组MUC5B相对含量(以短病程组为参照)。与中病程组比较，*P<0.05，与短病程组比较，△P<0.05

2.4中耳积液中MPO、NE和IL-8含量相关性分析

MPO与NE表达呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05),MPO、NE与IL-8表达呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 OME患者中耳积液MPO、NE、IL-8含量相关性分析

3、讨论

OME好发于6月～4岁儿童[6]，约90%的儿童在学龄前罹患OME[7]。研究发现，8岁以下儿童平均每年发作4次OME，持续性中耳积液通过影响鼓膜及听骨链活动度导致长期听力下降，影响患儿听力发育及学习能力，且随着病程延长，会进一步导致粘连性中耳炎、中耳胆脂瘤等问题[8-9]。提高OME的诊疗水平，缩短OME的慢性病程，减少复发，对儿童言语发育及防治耳聋有重要意义。

近年来，研究报道在中耳积液中发现了NETs成分。Thornton等[10]发现，慢性OME患者中耳积液中存在来源于中性粒细胞的DNA，并和NE共定位。Schachern等[11]报道，OME患者及动物模型中耳积液中存在组蛋白H4。一项研究在慢性OME患儿中耳积液中进行蛋白质组学分析发现了MPO、组蛋白及MUC5B，且含有高丰度的IL-8，提出NETs参与慢性OME的主要免疫反应[5]。这些研究表明，NETs可能参与了慢性OME发病，IL-8可能作为调控因子参与NETs形成。

Brinkmann等[3]将中性粒细胞被活化后释放到胞外的网状结构命名为NETs。随着研究深入，NETs被发现是由DNA、MPO、NE、组蛋白等多种蛋白构成的胞外大分子，这些蛋白质包绕DNA骨架形成网状结构。NETs不仅可以直接捕获微生物后利用局部高浓度的生物酶杀死细菌，也可以通过诱导多种炎症因子的产生，参与急性肺损伤、结肠炎及血栓等疾病，如NETs可通过刺激肺泡和支气管上皮细胞分泌IL-8、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等加重急性肺损伤，NETs促进溃疡性结肠炎肠黏膜上皮细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达从而维持炎症状态[3,12-15]。因NETs成分复杂，在释放过程中易降解，所以检测存在一定困难，目前大多针对NETs的主要蛋白成分及骨架DNA进行分析[16]。

我们利用免疫荧光发现，OME患者中耳积液中均有NETs的网状结构，NE、MPO和游离DNA共定位。Western Blot定量分析发现，中耳积液MPO、NE含量随病程延长而增多，IL-8水平也表现出同样趋势。Matkovic等[2]报道，当OME病程>3月时，中耳积液中IL-8浓度增加11倍。我们研究结果与之相似，中耳积液中IL-8含量随病程延长而增多，中病程组、长病程组量分别为短病程组1.5倍、2.5倍，提示NETs、IL-8均参与了OME的发生，且与病程延长相关。

相关性分析表明，MPO、NE含量的增多与IL-8增多相关。这可能由于IL-8作为中性粒细胞的趋化因子，不仅能激活中性粒细胞并募集在炎症部位，同时能通过以下途径参与NETs的形成：(1)血清中的中性粒细胞在IL-8活化下出现胞内钙增多，高浓度的钙激活肽酰基精氨酸脱亚氨酶Ⅳ(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)使组蛋白瓜氨酸化来诱导染色质去浓缩，并被一系列抗菌蛋白修饰最终形成NETs;(2)IL-8在体外还可通过激活MAPK通路，从而诱导NETs形成[17-21]。IL-8一方面通过激活蛋白激酶C活化p38MAPA，进而抑制自噬小体形成从而促进NETs形成；还可通过激活细胞外调节蛋白激酶活化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生活性氧，促进MPO和NE从胞内颗粒释放到胞质，同时MPO促进染色质解聚，最终形成NETs[18-19,22-23]。我们推测，OME的发病也可能存在与以上相同的机制。

前期研究发现，在人支气管上皮细胞中NETs也能选择性上调白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)家族因子，从而增加IL-8[24]。中耳黏膜与呼吸道上皮类似，在中耳黏膜中可能存在相同反应，当病原体侵犯中耳黏膜后，诱导IL-8生成增多，趋化中性粒细胞聚集生成NETs,NETs反之会通过调节IL-1而使IL-8含量升高，这种相互作用会导致中耳腔内持续存在炎症反应及积液，引起慢性OME迁延不愈。我们研究证实，中耳积液中含有MUC5B，与胞外DNA共定位，其含量也随病程延长而增加。MUC5B是大分子蛋白，当其黏附在NETs的网状结构上之后，会导致中耳积液更加黏稠，更不易自咽鼓管排出，进一步延长病程。

由于NETs参与了多种炎症性疾病[1 4]。针对NETs的主要成分的抑制剂已经成为新的治疗靶点并取得了一定的进展，如DNases目前被批准用于治疗肺囊性纤维化，西维来司钠用于治疗病毒感染引起的急性呼吸窘迫综合征[25-26]。本研究为慢性OME的治疗提供了新的思路，但IL-8通过何种信号通路调节中耳黏膜NETs生成和MUC5B表达仍需进一步研究。

参考文献:

[1]李雨青,赵辉.儿童分泌性中耳炎临床指南解析[J].中华耳科学杂志,2022,20(3):504-508.

[16]马雪妮,程龙,许慧梅,等.中性粒细胞外诱捕网检测方法的研究进展[J].中国免疫学杂志,2021,37(24):3056-3061.

[19]邹辛迪,李晓霞.中性粒细胞胞外陷阱在血液系统疾病发生发展中的作用[J].现代肿瘤医学,2023,31(1):188-191.

基金资助:甘肃卫生行业计划(GSWSKY2020-14);

文章来源:沈世敏,杨志强,徐雯,等.中性粒细胞诱捕网在儿童分泌性中耳炎中的机制研究[J].中华耳科学杂志,2024,22(06):1011-1015.