程序性细胞死亡蛋白受体-1(Programmeddeathreceptor 1,PD-1)又称分化簇279(CD279),属于B7共刺激因子家族,主 要在活化的 T淋巴细胞表面表达,其配体程序性细胞死亡蛋白 配体-1(Programmeddeath-ligand1,PD-L1)可在肿瘤细胞和多 种类型的细胞膜上表达｡PD-1与 PD-L1相互结合后能抑制 T淋巴细胞的增殖和细胞毒性,同时也促进 T 细胞的凋亡,从而 使肿瘤细胞逃避 T细胞的杀伤作用,最终介导肿瘤细胞发生免疫逃逸[1](图 2F)｡如果用抗 PD-1/PD-L1抗体阻断 PD-1与 PD-L1的结合,则可重新激活 T细胞的抗肿瘤功能并导致肿瘤 消退,这被 称 为 抗 PD-1/PD-L1 免 疫 治 疗 (以 下 简 称 免 疫 治 疗)｡免疫治疗因其疗效持久且极大地改善肿瘤患者的总生存 时间,成为了抗肿瘤治疗的一大突破性进展｡然而,有部分肿瘤却对免疫治疗无反应或低反应,这可以用外泌体 PD-L1(ExosomalPD-L1,ExoPD-L1)在肿瘤微环境中的免疫抑制作用来 部分解释这种差异[2]｡最新的研究显示,ExoPD-L1在肿瘤的 免疫逃逸中发挥着重要的作用,循环血浆 ExoPD-L1与多种恶 性肿瘤的诊断､疾病活动状态､免疫治疗反应､预后生存等有关[2-4]｡

1、外泌体的起源

几乎所有原核生物和真核生物的细胞,包括动物､植物､微 生物,都能释放外泌体[5]｡外泌体源自细胞膜表面的胞吞作 用,它是由细胞膜经过一系列的连续内陷后形成的一种分布于 细胞外的亚细胞囊泡,其最外层由脂质双层膜包围,直径范围 在30~200nm 之间,平均直径为100nm [5-7]｡外泌体几乎存 在于所有的体液中,如血液､胆汁､乳汁､尿液､精液､羊水､腹 水､脑脊液和唾液等[8]｡外泌体始于细胞膜内吞形成的内涵 体,内涵体向胞内发芽､凹陷,依次形成早期核内体和晚期核内 体(Late-sortingendosome,LSE),此时的 LSE 经演变后,变成 了包裹有蛋白质､脂质､核酸等物质的多个腔内囊泡(Intraluminalvesicles,ILVs)[9],也称为外泌体前体｡在运输所需的内 体分 选 复 合 物 (Endosomalsorting complexesrequiredfor transport,ESCRT)的驱动作用下[10],ILVs随即发育成为多囊 泡小体(Multivesicularbodies,MVBs)｡多数的 MVBs与溶酶 体融合,并被其降解,最后再被细胞提取后循环利用｡只有少 数 MVBs在 RabGTP酶家族[11]和可溶性 NSF附着蛋白受体 家族(solubleNSFattachmentproteinreceptor,SNARE)[12]的 辅助下与细胞膜融合形成具有特定功能的外泌体(图1)｡正 常细胞和肿瘤细胞均可释放外泌体,但是肿瘤细胞能释放出比 正常细胞更多量的外泌体,促进恶性肿瘤的发生发展[13-14]｡

图1 外泌体的发生和释放的示意图

2、ExoPD-L1与肿瘤微环境的关系

肿瘤微环境是指肿瘤细胞所处的内外环境,在肿瘤的发 生､生长､转移中起重要作用,由免疫细胞､成纤维细胞､细胞外 基质､血管､基底膜､内皮细胞和癌细胞组成,外泌体在介导肿 瘤微环境的通讯中起关键作用[15-19]｡肿瘤患者外泌体在机体 内的含量约是健康人的数倍,且在肿瘤微环境中具有良好的稳 定性[13]｡外泌体将生物体内的 microRNA､mRNA､脂质､蛋白 质从供体细胞转移到靶细胞来调节或重新编码肿瘤微环境中 的各个组成成分[20-21],改变肿瘤细胞和免疫细胞的结构功能, 最终促进肿瘤进展[22-23]｡肿瘤细胞分泌的外泌体能携带 PDL1,即 ExoPD-L1,其在肿瘤微环境中可取代细胞表面 PD-L1, 产生抑制 T细胞活化的作用,从而为肿瘤细胞的生长创造适宜 的条件,形成免疫抑制的肿瘤微环境[3,24]｡抗 PD-1/PD-L1治疗的成功在很大程度上取决于注射的抗体激活 T 细胞后 T 细 胞自身清除肿瘤细胞的能力,以及肿瘤浸润相关淋巴细胞的辅 助杀伤能 力[25]｡而 ExoPD-L1 能 产 生 抑 制 T 细 胞 活 化 的 作 用,削弱 T细胞杀伤肿瘤细胞的能力,这可以部分解释少数肿 瘤免疫治疗效果不佳的原因[4]｡以上机制的研究,为我们探索 ExoPD-L1在肿瘤免疫逃逸中的机制奠定了理论基础｡

3、ExoPD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用

ExoPD-L1通过多种途径抑制 T 细胞免疫反应,可以概括 为直接或间接与 T细胞表面的 PD-1结合后抑制 T 细胞活化, 介导肿瘤细胞发生免疫逃逸,最终促进肿瘤进展[26],见图2｡

图2 肿瘤微环境及 ExoPD-L1诱导免疫抑制的机制

3.1 ExoPD-L1直接与 T 细胞表面的 PD-1结合诱导免疫抑 制(图2A)随着对外泌体研究的深入,在多种恶性肿瘤中均发 现 ExoPD-L1可通过与 T 细胞表面的 PD-1结合而诱导 T 细 胞的免疫抑制效应｡在黑色素瘤的研究中,Chen等[27]利用免 疫电子显微镜和酶联免疫吸附试验验证出 ExoPD-L1与肿瘤 细胞膜 PD-L1具有相同的膜拓扑结构,ExoPD-L1以浓度依赖 性方式与 T 细胞表面的 PD-1直接结合｡当 CD8+T 细胞上 的 PD-1或 ExoPD-L1的水平上调时,外泌体与 CD8+T 细胞 的结合增加,起到免疫抑制作用,并促进肿瘤生长｡在对恶性 黑色素瘤的研究中还发现 ExoPD-L1会抑制 CD8+T 细胞分 泌干扰素 -γ(IFN-γ)､白 介 素-2(IL-2 )和 肿 瘤 坏 死 因 子-α (TNF-α),导致免疫抑制作用进一步加强[27]｡同样,在对胶质 母细胞瘤､肺癌､乳腺癌的研究中也证实了 ExoPD-L1可与 T 细胞表面的 PD-1直接结合并抑制 T 细胞的活化,诱导免疫抑 制[24,28-29]｡值得注意的是,Himes等[30]的研究还发现 ExoPDL1是通过激活免疫抑制单核细胞而非直接结合 T 细胞表面 PD-1实现肿瘤免疫逃逸的,这可能与外泌体的异质性､T 细胞 不同的刺激方式有关,具体的机制还有待进一步研究｡

3.2 ExoPD-L1迁移到 PD-L1 阴性细胞表面后间接诱导免疫 抑制(图2B)基于外泌体可以将生物体内的核酸､脂质､蛋白质 从供体细胞转移到靶细胞,调节靶细胞功能状态的原理[20],有 研究者设计实验去探索外泌体是否可以将 PD-L1转移到其它 低或无 PD-L1表达的细胞上去｡在对乳腺癌小鼠模型的研究 中,Yang等[24]向 ExoPD-L1KO 的实验鼠体内分别注射了 PD-L1表达阴性和阳性的外泌体,5天后在注射 ExoPD-L1阳性的 实验鼠体内检测到了 PD-L1的转移,且流式细胞术分析提示 外泌体运输的 PD-L1位于靶细胞表面,说明了外泌体具有诱 导 PD-L1低表达或不表达的细胞获得 PD-L1的能力｡该研究 同时发现 ExoPD-L1 可 以 迁 移 到 多 种 类 型 的 细 胞 中 去,包 括 PD-L1 阴性的肿瘤细胞､巨噬细胞和树突状细胞｡此外,Yang 等[24]还将含 PD-L1的外泌体与 PD-1Fc重组蛋白一起孵育, 利用流式细胞学技术分析显示覆盖在 PD-L1阴性肿瘤细胞表 面上的 ExoPD-L1也能 与 PD-1Fc片 段 结 合,抑 制 T 细 胞 活 性｡综上,ExoPD-L1能迁移到PD-L1阴性细胞表面与 T 细胞 的 PD-1结合诱导免疫抑制,减弱 T 细胞杀伤肿瘤的能力,促 进肿瘤生长[24]｡

3.3 ExoPD-L1迁移到区域淋巴结以耗竭 T 细胞诱导免疫抑 制(图2C)恶性肿瘤的区域淋巴转移可改变 T 细胞的免疫应 答,产生肿瘤特异性免疫耐受,促进肿瘤远处转移[31]｡ExoPDL1可通过抑制 T细胞活性和细胞因子的分泌,诱导局部及全 身免疫抑制反应,促进肿瘤增长[32]｡在前列腺癌的小鼠模型 中,研究者先用 Rab27a和nSMase2的基因敲除方法来阻止实 验鼠 ExoPD-L1的生物发生,随后再引入肿瘤源性 ExoPD-L1, 结果观察到引流淋巴结中 CD8+T细胞数目减少,并且其效应 功能也受到抑制[32]｡对黑色素瘤的研究中也观察到 ExoPDL1能使淋巴结中 CD8+T 细胞比例降低,抑 制 T 细 胞 的 活 化[27]｡以上研究均说明 ExoPD-L1 能够迁移至区域淋巴结中 耗竭 T细胞数目,介导 T细胞发生免疫抑制｡

3.4 ExoPD-L1迁移到脾脏抑制脾脏免疫反应,使脾脏变小及 抑制 T 细胞增殖(图2D)脾脏是机体最大的免疫器官,含有大 量的淋巴细胞和巨噬细胞,是免疫应答发生的场所,可通过多 种机制产生抗肿瘤效应[33]｡Poggio等[32]先在能正常分泌 ExoPD-L1的前列腺癌小鼠模型中观察到,脾脏中 T 淋巴细胞的 增殖受到抑制,并且其免疫效应也受到抑制｡接着,又通过基 因敲除的方法阻断 ExoPD-L1生物发生,发现脾脏 T淋巴细胞 可被激活､增殖增加并解除了免疫抑制状态｡最后,他们又向 被敲除了 ExoPD-L1生物发生基因的前列腺癌小鼠注射外源性 ExoPD-L1,观察到脾脏免疫功能再次受到抑制,小鼠的脾脏 大小减少近 50%｡此外,Chen [27]在黑色素瘤小鼠中引入 B16- F10细胞来源的 ExoPD-L1,发现脾脏中 CD8+T 细胞的比例 降低,表明 ExoPD-L1抑制了抗肿瘤的免疫反应｡综上,肿瘤 源性 ExoPD-L1可以通过血液循环迁移到脾脏,介导脾脏 T 细 胞发生免疫抑制｡

3.5 ExoPD-L1与 抗 PD-L1 抗 体 结 合 诱 导 免 疫 治 疗 耐 药 性 (图2E)抗 PD-1/PD-L1单克隆抗体通过阻断 PD-1与 PD-L1 的结合从而恢复 T细胞的功能,实现抗肿瘤的作用,但 ExoPDL1却可以破坏这种作用[4]｡IFN-γ在肿瘤的免疫监视中发挥 重要作用,IFN-γ可以上调 MHC-I类分子的 表 达,从 而 促 进 CD8+T 细胞识别肿瘤 细 胞[34-35]｡Kim 等[29]发 现 ExoPD-L1 能抑制人淋巴母细胞 T 细 胞 系(JurkatT 细 胞)分 泌IFN-γ, ExoPD-L1通过PD-1/PD-L1通路来调节 T细胞中的IFN-γ信 号传递,导致 T 细胞活性降低,介导 T 细胞发生免疫抑制[29]｡ 在前列腺癌小鼠模型中,研究人员发现由于实验组 ExoPD-L1 的存在,肿瘤细胞对抗 PD-L1抗体治疗无反应 或 低 反 应[32]｡ 在头颈部鳞癌的患者中,还观察到 ExoPD-L1高表达组表现出 更加明显的抑制 T 细胞活化的现象,且这种现象能被抗 PD-1 抗体所阻断[36]｡以上研究表明,ExoPD-L1在免疫治疗中扮演 着重要角色｡ExoPD-L1能与抗 PD-L1抗体结合,耗竭抗 PDL1抗体,使得肿瘤细胞表面的 PD-L1结合的抗 PD-L1抗体数 目减少,导致更多数量的肿瘤细胞PD-L1能够与 T细胞的PD1结合并抑制 T细胞的抗肿瘤作用,诱导免疫治疗耐药性[4,26]｡

4、ExoPD-L1作为恶性肿瘤潜在的生物标志物

目前,临床上多采用免疫组化检测肿瘤细胞 PD-L1表达 量作为免疫治疗反应的预测因子,但该方法具有活检创伤大､ 取材不方便､难以动态跟踪､不能避免肿瘤异质性以及敏感性 有限的缺点[37]｡最近的研究表明,循环血浆 ExoPD-L1正在成 为一种不依赖病理标本､重复性强､稳定性高､创伤小､易动态 跟踪的生物标志 物,在 临 床 上 具 有 极 大 的 潜 在 运 用 价 值[37]｡ 现将循环血浆 ExoPD-L1作为恶性肿瘤潜在生物标志物的相 关临床研究归纳总结,见表1｡

表1 循环 ExoPD-L1与恶性肿瘤相关性的临床研究

4.1 ExoPD-L1作为肿瘤诊断的生物标志物 与健康个体相 比,肿瘤患者循环血浆里可检测出更 高 水 平 的 外 泌 体 及 ExoPD-L1,很有可能与肿瘤细胞分泌更多的肿瘤源性外泌体有 关[37]｡Li等[38]将 85 例 非 小 细 胞 肺 癌 (Nonsmallcelllung cancer,NSCLC)患者和27名健康个体进行循环血浆 ExoPDL1水平的检测,结果显示I/II期和III/IV 期 NSCLC 患者的 ExoPD-L1水平明显高于健康对照组(P<0.05),差异具有统 计学意义｡同样,在对恶性黑色素瘤患者(n=44)和健康个体 (n=11)ExoPD-L1表达水平做对比分析也显示两者具体明显 的统计学差异(P=0.00002),在 ROC曲线最佳截值的情况下, 诊断的灵敏度､特异度分别为86.36%和90.91% [27]｡但是,在 胰腺疾病中,Alexander等[44]使用流式细胞术荧光强度的分析 方法,将慢性胰腺炎(n=26)和胰腺导管腺癌(Pancreaticductal adenocarcinoma,PDAC)(n=55)的患者血浆 ExoPD-L1做对比 研究却发现慢性胰腺炎的平均荧光强度甚至高于 PDAC患者, 他们认为 ExoPD-L1不适合作为胰腺癌诊断的生物标志物(敏 感度=14%,特异度=94%,P=0.3583),这可能与病例纳入标 准和样本量有关系｡总体来说,循环血浆 ExoPD-L1有望成为 肿瘤诊断的潜在生物标志物｡

4.2 ExoPD-L1作为判断肿瘤疾病活动状态的生物标志物 与循环血浆里可溶性 PD-L1､肿瘤细胞膜 PD-L1不同,ExoPDL1可以迁移到远隔部位与 T 细胞表面的 PD-1相互作用并抑 制 T细胞的活性,影响疾病的活动状况[27]｡在一项前瞻性研 究中,研究者对纳入的85例 NSCLC患者按肿瘤分期､肿瘤大 小､淋巴结状态､有无远处转移等临床病理学特征进行分层分 析,结果显示肿瘤较大(直径>2.5cm)(P<0.001)､淋巴结阳 性(P<0.05)和 远 处 转 移 (P<0.05)的 NSCLC 患 者 中,ExoPD-L1水平较高,且与其表达量呈正相关[38]｡同样,在对40 例头 颈 部 鳞 癌 (Squamouscellcarcinomaofheadandneck, HNSCC)患者的研究中也显示高水平 ExoPD-L1与淋巴结状 态､远处转移和 TNM 分期有相关性(P<0.05)[36]｡此外,疾 病进展与可溶性 PD-L1水平无关,阻断 ExoPD-L1到 PD-1的 信号传导通路后会使 T 细胞受到的免疫抑制作用减弱,循环 ExoPD-L1可以作为判断 HNSCC患者疾病活动状态和免疫活 性的有用指标[36]｡因此,循环血浆 ExoPD-L1有望成为一种判 断肿瘤疾病活动状态的潜在生物标志物｡

4.3 ExoPD-L1作为预测肿瘤治疗应答情况的生物标志物 目前,免疫治疗已成为多种恶性肿瘤的标准一线治疗,早期精 准识别免疫治疗应答者和无应答者显得尤为重要｡一项纳入 44例不同类型的晚期恶性肿瘤的研究中,显示对免疫治疗有 应答者(n=20)ExoPD-L1 表 达 水 平 明 显 低 于 无 应 答 者 (n= 24),P 值为0.010,两者的表达具有明显的统计学差异[47]｡并 且 ExoPD-L1 低 表 达 水 平 的 患 者 具 有 更 长 的 无 进 展 生 存 期 (7.7月vs2月,P=0.001)[47]｡Chen等[27]在黑色素瘤的研究 中,发现对抗 PD-1药物免疫治疗反应较差的黑色素瘤患者,其 治疗前循环 ExoPD-L1水平明显高于治疗应答者｡且在治疗 早期阶段,ExoPD-L1的增加幅度也可用来区分免疫治疗应答 者和无应答者,这为应用 ExoPD-L1作为抗 PD-1治疗的预测 因子提供了一定的依据[27]｡最近,Cordonnier等[43]对比了接受抗 PD-1治疗的黑色 素 瘤 患 者 治 疗 前 后 ExoPD-L1 变 化 水 平,发现治疗后无应答､疾病进展患者的 ExoPD-L1水平明显 升高(P=0.0002),监测 ExoPD-L1治疗前后的变化水平有助 于预测治疗效果和临床结局｡DEL等[48]还对接受免疫治疗前 后的非小细胞肺癌和黑色瘤患者 ExoPD-L1mRNA 进行分析, 均发现 mRNA 拷贝数在治疗应答者中下降､无应答者中上升, ExoPD-L1与治疗 应 答 情 况 显 著 相 关｡因 此,检 测 循 环 血 浆 ExoPD-L1表达情况有望成为预测肿瘤治疗应答情况的良好生 物标志物｡

4.4 ExoPD-L1作为肿瘤预后的生物标志物 在一项对55例 PDAC术后患者进行长期随访的研究中,研究人员先是根据患 者术前血浆 ExoPD-L1表达水平绘制出 ROC 曲线,然后以最 佳诊断截值为界区分出阴性和阳性患者,结果发现 ExoPD-L1 阳性 PDAC患者的术后生存时间比阴性患者更短(7.8月 vs 17.2月,P=0.043),他们认为 ExoPD-L1是一种不良预后因 素[44]｡在一项回顾性分析69例胃癌患者术前血浆中 ExoPDL1和可溶性 PD-L1的预后价值研究中,与 ExoPD-L1低表达 水平组相比,高表达水平组的总生存期显著降低(P=0.004), 且 ExoPD-L1是胃癌预后的独立危险因素,可溶性 PD-L1与总 生存没有相关性[40]｡在黑色素瘤患者中,治疗前 ExoPD-L1水 平越 高,其 肿 瘤 负 荷 越 重,这 被 认 为 是 预 后 不 良 的 重 要 征 象[27]｡同样,在 HNSCC､恶性黑色素瘤的研究中也发现 ExoPD-L1与预后不良显著相关,高水平的 ExoPD-L1预示着更 差的临床结局[37]｡此外,循环 ExoPD-L1在弥漫大 B 细胞性 淋巴瘤中的表达水平也与预后具体相关性,它是无进展生存期 和总生存期的重要预后因素[45]｡因此,循环血浆 ExoPD-L1有 望成为肿瘤患者预后生存情况的生物标志物｡

5、总结与展望

外泌体在肿瘤的早期诊断､抗肿瘤治疗､药物载体､疫苗研发方面表现出了巨大的潜力[6],如抑制外泌体的生物发生和释 放有望成为抗肿瘤治疗的新策略｡由于肿瘤细胞和免疫细胞 均可分泌外泌体,出现了两种细胞源性外泌体在生理活动中起 相互拮抗的现象,如果在抗外泌体肿瘤治疗中无选择性的抑制 外泌体分泌可能会有潜在的不良影响[5]｡如何靶向抑制肿瘤 源性外泌体分泌,以期更好的将外泌体抑制剂应用于临床是今 后抗外泌体肿瘤治疗研究的重点领域｡

ExoPD-L1与恶性肿瘤关系密切,它可以通过多种途径介 导肿瘤细胞发生免疫逃逸,这些机制的研究丰富了肿瘤细胞 PD-1/PD-L1途径,同时也可部分解释少数肿瘤免疫治疗效果 不佳的原因,为抗 PD-1/PD-L1治疗提供了新思路,ExoPD-L1 有望成为免疫治疗的潜在靶标｡但仍面临诸多挑战,如①设计 出一种高效､精准的抑制或抗 ExoPD-L1的药物可能是肿瘤免 疫治疗方面的一个重要补充,特别是既能精准靶向抑制肿瘤源 性 ExoPD-L1又能同时减轻免疫治疗毒性的药物,也许是今后 抗肿瘤免疫治疗的研究热点｡②由于肿瘤微环境的复杂性和 外泌体的异质性,还需要综合评估不同细胞来源的外泌体及 ExoPD-L1对机体的影响,尚需更多的基础与临床研究来填补 此项空缺｡③除在部分肿瘤患者中已经证实了 ExoPD-L1表 达水平与IFN-γ具有相关性外,我们还不太清楚其它细胞因子调节 ExoPD-L1的发生释放机制和其它免疫检测点(如 CTLA4,LAG-3,TIM-3)在外泌体中的功能作用[3,37],以及各个免疫 检测点之间的联系,这仍需要大量的前瞻性研究去做进一步补 充｡循环血浆 ExoPD-L1作为肿瘤的生物标志物显现出了巨 大的潜力,具有重要的临床意义,但目前国内外在该方面纳入 的临床研究､病例样本量均较少,还需要在较大的患者队列和 多种肿瘤类型中进行评估｡总体而言,ExoPD-L1在肿瘤的早 期诊断､发生发展､免疫抑制､免疫治疗以及耐药中具有极其重 要的作用｡如果将 ExoPD-L1相关理论研究广泛的运用于临 床,就还需要解决诸多问题,包括 ExoPD-L1表达水平的具体 分界､潜在细胞因子调节 ExoPD-L1的生物发生机制､如何精 准靶向 ExoPD-L1治疗肿瘤等｡这些问题的解决,对探索肿瘤 综合治疗提供参考价值,也可为进一步解决免疫治疗抵抗/耐 药的问题提供新思路｡

参考文献:

[21]王科,马敏,蒋晋安,等.鼻咽癌外泌体通过 LncTUG1促进内 皮细胞增殖和血管生成 [J].西部医学,2022,34(3):367-374.

文章来源:郭飞,陈巧玲,宋俊梅,等.外泌体PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的研究进展[J].西部医学,2025,37(01):151-156.