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近红外荧光分子探针Cy5-G3CNGRC靶向肿瘤血管生成显像

2023-11-14 68 上传者：管理员

摘要：目的:CD13受体是肿瘤血管生成过程的重要调节因子，而天冬酰胺酰-甘氨酸-精氨酸(NGR)氨基序列是CD13的特异性配体；我们制备了Cy5-GGGCNGRC(Cy5-G3CNGRC),以期为研究肿瘤血管生成提供一种新的影像方法。方法:以活化酯法制备Cy5-G3CNGRC经HPLC纯化后备用；分别以永生化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人主动脉内皮细胞(HAEC)及CD13阳性表达的人纤维肉瘤细胞(HT-1080)和阴性表达的人直肠癌细胞(HT-29)建立体外细胞学模型以观察Cy5-G3CNGCR细胞学摄取情况；建立HT-29和HT-1080荷瘤小鼠模型通过腹腔注射Cy5-G3NGR(200μg/只)后0.5、1、2和4 h分别进行活体荧光成像，并计算肿瘤(靶，target, T)组织与肌肉(非靶，non-target, NT)组织的T/NT比值，然后对这些数据进行统计学分析。结果:细胞学实验结果提示，HUVEC、HAEC及HT-1080对Cy5-G3CNGRC摄取明显，而HT-29则几乎不摄取；HT-1080移植瘤最大T/NT比值明显高于HT-29移植瘤(2.25±0.49 vs 1.05±0.08,P=0.004 7,n=5),且高峰值出现在注射后2 h左右。结论:Cy5-G3CNGRC在体内及体外均表现出了对CD13良好的亲和性，在肿瘤新生血管荧光成像方面有一定的应用价值。

关键词：
CD13
分子探针
天冬酰胺酰-甘氨酸-精氨酸(NGR）
荧光成像
血管生成
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血管生成是肿瘤细胞生长和转移的关键，肿瘤血管生成是指新的毛细血管从原有的血管系统中分支出来而形成一个完善的血管网络，维持肿瘤内适当和不受限制的营养和氧气稳态[1];是启动血管生成激活的多步骤过程刺激促血管生成调节和抑制抗血管生成调节的开关[2]。血管生成是癌症的一个重要标志，针对血管生成的分子决定因素的研究也成为研究热点[3]。大量研究证明，CD13受体也被称为氨肽酶N(APN),是肿瘤血管生成过程中内皮细胞形态发生的重要调节因子，是一种锌依赖性膜结合的降解外肽酶优先选择含有N端中性氨基酸的蛋白质和多肽[4]并且与多种肿瘤的进展有关，如前列腺癌、胰腺癌等[5,6]。NGR最初是通过在体内筛选噬菌体展示肽文库被发现的一种氨基酸序列[7],随后，研究证实NGR的肽可与CD13特异性结合，因此，许多含有NGR的衍生物已被开发用于CD13靶向肿瘤成像和治疗[8,9,10]。

近红外荧光(near-infrared fluorescence, NIRF)成像技术是一种极好的非侵入性技术，可以在分子水平上研究活体疾病。作为其他影像技术如正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)及磁共振(MRI)的极好补充，NIRF成像不使用电离辐射或放射性物质，使其具有成本效益，稳定性好，灵敏度高，并且比其他成像方式直接[11,12]。因此，本研究设计并制备荧光染料标记的NGR,并进行体外及体内实验，以期为研究肿瘤血管生成提供一种更简单、直观的影像学方法。

1、材料与方法

1.1 主要实验材料和仪器

G3CNGRC-NH2、Cy5-NHS均购于合肥拜尔迪化学科技有限公司，0.1%TFA 水及 0.1%TFA 乙腈(HPLC用)购于天津市康科德科技有限公司，人纤维肉瘤细胞系(HT-1080,CD13+)、人直肠癌细胞(HT-29)、永生化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉内皮细胞(HAEC)购于武汉丹港生物科技有限公司，DEM、RM1570培养基(Bioland 公司),ECM内皮细胞专用培养基(sciencell 公司),胎牛血清(Gbico, Bioland 公司),BALB/c 裸鼠(8周龄，雌雄各半，共10只)购于重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司；小动物活体荧光成像系统(Berthold Night Owl, 德国),倒置荧光显微镜(Olympus IX51,日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 Cy5-G3CNGRC的合成

Cy5-G3CNGRC的合成方法根据文献报道进行[13],简述如下：将G3CNGRC肽(5 mg)溶解于100 μL PBS(pH 8.5)中，将Cy5.5-NHS(5 mg)加入10 μL DMSO和100 μL乙腈中，在室温下避光摇匀反应30 min后，以 HPLC纯化反应产物，收集含有所需产物的峰，冻干得到Cy5-G3CNGRC肽，存储于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 细胞培养及Cy5-G3CNGRC细胞学摄取实验

复苏细胞：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37 ℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5 mL培养基混合均匀。在1 000 r/min条件下离心5分钟，弃去上清液，补加10 mL完全DEM(HT-1080)/RM1570(HT-29)/ECM(HUVEC、HAEC)培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入75 mL培养瓶中，在37 ℃,10%FBS,5%CO2,1%青霉素+1%链霉素条件下培养过夜。第二天换液并检查细胞密度，每48小时换液1次；细胞传代：当细胞密度达80%～90%时，进行传代培养、扩增；细胞CD13表达荧光显微镜检测：将HT-180,HT-29,HUVEC及HAEC细胞以2×105/孔接种于24孔培养板中，培养过夜，换液后，每孔加入100 μL Cy5-G3CNGRC,继续培养1小时后，弃去培养液，以5%甲醛固定15分钟后，用PBS冲洗3次，然后在荧光显微镜下观察细胞CD13表达情况。

1.2.3 动物模型建立及荧光显像

BALB/c 裸鼠8周龄，雌雄各半，共10只，体重25 g/只左右，饲养于无特殊病原体(SPF)级环境中。垫料经紫外线消毒，小鼠饲料及饮用水均经高压灭菌处理。将上述方法培养的HT-29 和 HT-1080 细胞以5×106 /只接种于小鼠右侧腋下，继续饲养，待肿瘤生长至1 cm左右时行荧光显像(成像条件：Excitation Filter 630/20 nm, CWL 630 nm, HBW 20 nm, T 100%,Lamp Intensity 10%;Emission Filter: 700/20 nm, CWL 700 nm, HBW 20 nm, T 100%;Camera Gain low 4,Exposure Time 0.1 s)。显像方法：将Cy5-G3CNGRC溶于生理盐水中，避光条件下操作，充分摇匀后通过腹腔注射200 μg/只(封闭组先注射G3CNGRC 200 μg后再注射Cy5-G3CNGRC);称重小鼠，以2%的戊巴比妥钠按45 mg/kg缓慢腹腔注射，麻醉小鼠；分别于注射后0.5、1、2及4 h进行显像；采用感兴趣区域技术(region of interest, ROI),以肿瘤作为靶组织(target, T ),肌肉组织作为非靶组织(non-target, NT)测定单位面积下荧光强度，并计算T/NT值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对上述获得的结果进行统计和分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差

来表示，均数间的比较采用未配对t检验与韦尔奇的修正)(Unpaired t test with Welch's correction),P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Cy5-G3CNGRC的合成

HPLC结果显示，Cy5-G3CNGRC在色谱柱中(300 mV,220 nm)平均滞留时间在12.5 min(图1),经纯化冻干后得到深蓝色粉末7.5 g, 产额为75%。质谱分析结果示Cy5-G3CNGRC实际分子量为1 185.40,与理论分子量1 184.54很接近(图2),表明通过该法所合成的Cy5-G3NGR对结构及分子量基本上没有影响。

图1 Cy5-G3CNGRC HPLC结果

图2 Cy5-G3CNGRC质谱分析结果

2.2 细胞培养及荧光结果

细胞培养扩增后在显微镜下观察细胞状态，通过荧光显微镜可观察到，HUVEC 和HAEC 均可以摄取 Cy5-G3CNGRC,HT-1080细胞明显摄取，而HT-29细胞不摄取(图3)。

2.3 动物模型荧光显像结果

经腹腔注射后HT-1080 移植瘤(图4B)荧光摄取明显高于HT-29移植瘤(图4A),且HT-1080 移植瘤在摄取荧光探针可被G3CNGRC抑制(图4C)。半定量分析结果显示，HT-1080移植瘤摄取峰值在注射后2 h, 平均T/NT比值为2.25±0.49,注射后4 h移植瘤T/NT值开始逐渐下降，而HT-29对荧光探针的摄取则无明显峰值，统计学分析结果显示，HT-1080移植瘤T/NT值明显大于HT-29移植瘤(2.25±0.49 vs 1.05±0.08,P=0.004 7,n=5)(图5)。

3、讨论

大量研究表明，CD13上调不仅仅是血管生成和炎症的标志或附带现象，而且还可能具有重要的病理生理作用[14]。此外CD13还在调节激素和细胞因子、病毒感染、抗原呈递、细胞分化和增殖、细胞凋亡、内吞作用、细胞黏附和迁移以及组织侵袭等方面发挥着多种功能[15]。有研究显示，这种酶与癌症、白血病、心肌梗死、类风湿关节炎和其他炎症性疾病的发病机制有关[16,17,18]。在内皮细胞中，CD13被血管生成信号激活，并作为细胞侵袭和足蹼形成的调节剂，这对血管生成至关重要。此外，CD13缺失小鼠对生长因子的血管生成反应降低，在缺氧条件下促进视网膜新生血管的能力明显不足。CD13缺失小鼠在植入黑色素瘤和Lewis肺癌细胞后也表现出肿瘤生长减少[19]。CD13在血管生成中的作用并不局限于这种酶的“血管”形式。事实上，最新研究表明，表达CD11b和CD13的骨髓细胞亚群直接参与肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移。因此，一种由血管细胞表达的CD13形式和一种由骨髓源性骨髓细胞表达的CD13形式似乎在血管生成中发挥了关键作用。值得注意的是，含有CNGRC基元(二硫桥接)的肽可以识别血管生成血管的CD13阳性细胞，但不能识别CD13阳性表达的骨髓来源的髓样细胞[20],这表明这两种形式是不同的，CNGRC对“血管”形式具有选择性。这些结果表明，NGR既能识别肿瘤组织的血管生成血管，也能识别非肿瘤组织的血管生成血管。因此，NGR肽不仅可以靶向肿瘤血管，还可以靶向不同组织的其他生理性或病理性血管生成血管[21]。本研究的细胞学实验结果显示HUVEC和HAEC均表现为明显摄取Cy5-G3CNGRC,这一结果提示CD13可能参与了新生的静脉和动脉内皮细胞增生过程的调节，但具体机制有待进一步的研究。HT-1080细胞(阳性表达CD13)和HT-1029(不表达CD13)的细胞株目前被国内外学者广泛用于NGR细胞学实验的阳性对照及阴性对照，本研究的细胞学实验结果与文献报道相一致[13,22]。

图3 Cy5-G3CNGRC细胞荧光结果

图4 移植瘤模型活体荧光成像

新生血管的形成与肿瘤的生长、转移和侵袭密切相关。因此，肿瘤血管靶向是肿瘤分子影像学研究的一个重要热点。大多数肿瘤血管内皮细胞表面高水平表达αvβ3整合素和APN,而在正常成熟组织的毛细血管内皮细胞表面通常不表达αvβ3和APN。这些分子参与肿瘤血管、内皮细胞生长和肿瘤生长的调控。分子成像研究表明，integrin-RGD和APN-NGR氨基酸序列可用于制备特异性肿瘤靶向造影剂[21]。本研究动物实验结果显示在注射后2 h 内T/NT比值达到高峰后便开始下降，提示活体荧光成像最佳时间在注射后2 h以内，产生这一现象的原因可能与G3CNGRC在体内4～6 h发生脱酰胺反应有关[13],而在注射后4 h两种移植瘤的T/NT比值无明显差异，可能与样本量偏小及荧光发生猝灭有关[22],而这一变化趋势与HUANG Rui等[13]报道的结果相似。

Cy5是一种长波长的荧光染料，其发射波长在650 nm左右。这种染料可以通过共价键结合到蛋白质或肽分子上，形成Cy5-蛋白质或肽复合物，这种复合物可以在赏光显微镜下观察到，从而被应用于研究蛋白质的分布和相互作用。荧光染料标记蛋白的原理是利用化学反应将染料与蛋白质共价结合，这种反应需要在一定条件下进行，例如在碱性条件下，使用活性酯化合物将染料与蛋白质分子上的氨基酸残基反应，这种反应可以在室温条件下进行，反应时间通常为0.5～1小时[23]。本实验通过活化酯法制备Cy5-G3CNGRC并通过体内外实验证实可靶向结合到CD13阳性表达的肿瘤，为研究肿瘤血管生成提供一种更简单、直观的影像学方法。但荧光光子穿透力较弱且荧光成像易产生噪声，因此多用于细胞学及小动物表浅病变模型的研究。

图5 注射Cy5-G3CNGRC后不同时间点移植瘤T/NT比值

本研究的不足之处在于细胞学摄取实验中未对实验用细胞进行细胞核染色致使细胞轮廓显示模糊，不能分辨出Cy5-G3CNGRC在细胞内的分布情况；此外本研究只是针对已知CD13阳性和阳性表达的肿瘤细胞移植瘤进行显像，未对其它类型的恶性肿瘤细胞及其移植瘤进一步显像以证实该探针的应用潜力。

基金资助:贵州省基础研究计划(自然科学类)项目(编号:黔科合基础[2019]1325号);

文章来源:王娇亚,刘松松,陶敏等.近红外荧光分子探针Cy5-G3CNGRC靶向肿瘤血管生成显像的实验研究[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4519-4523.