内皮细胞活化和血管生成是许多病理条件的共同特征，包括类风湿关节炎、癌症、黄斑变性、动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病性溃疡、中风、骨折、伤口愈合障碍等[1,2]。因此，寻找并鉴定被激活的内皮细胞选择性表达的新受体，并发现能够与它们相互作用的血管功能调节剂或新的配体，内皮细胞活化和血管生成是许多病理条件的共同特征，包括类风湿关节炎、癌症、黄斑变性、动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病性溃疡、中风、骨折、伤口愈合障碍等[1,2]。因此，寻找并鉴定被激活的内皮细胞选择性表达的新受体，已成为血管靶显像和治疗研究的热点。研究发现，氨基肽酶N(CD13)是一种多功能膜结合酶金属蛋白酶，并被发现该酶在血管生成这一过程中表达上调。抗血管生成治疗是恶性肿瘤的一种新兴疗法[3,4],在临床应用中已取得较好的疗效，但如何更准确地动态评价疗效及预测预后是目前所面临的难题，常规影像学方法需要在肿瘤出现明显的结构异常如坏死或者空洞的形成才能被发现，而这些改变的出现需要一定的时间，因而不能及时对抗血管生成药物的疗效做出及时靶向的评价。而分子影像则可以解决以上问题，因此，本研究合成了DOTA-G3NGR,并用99Tcm进行标记并进行肿瘤动物模型显像，以期为抗血管生成药物靶向疗效评价提供一种新的方法。

1、材料与方法

1.1 实验材料

2-Cl 树脂(2-氯三苯甲基氯树脂)(分析级，合肥拜尔迪化学科技有限公司);Fmoc-AA-OH(N-[芴甲氧羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸)(分析级，合肥拜尔迪化学科技有限公司);DCM(二氯甲烷)(分析级，上海九井实业有限公司);DIEA(N,N-二异丙基乙胺)(分析级，天津市康科德科技有限公司);甲醇(分析级，天津市康科德科技有限公司);DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(分析级，天津市康科德科技有限公司);20%哌啶/DMF(天津市康科德科技有限公司);检测试剂 A(5 g 茚三酮-100 mL乙醇)、B(分析级吡啶)(分析级，合肥拜尔迪化学科技有限公司);HOBT(1-羟基苯并三唑)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)(分析级，苏州昊帆生物股份有限公司);N-(9-芴甲氧羰基)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸[Fmoc- CYS(TRT)-OH]、Fmoc- ARG(PBF)-OH[N-(9-芴甲氧羰基)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸]、N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸[FMOC-Arg(Pbf)-OH]、DOTA-NHS(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)(分析级，均购于合肥拜尔迪化学科技有限公司)。

1.2 主要实验仪器

电子天平(0.1 mg)(FA1604,上海方瑞仪器有限公司),循环水式真空泵离心机(SHZ-D3,上海羌强实业发展有限公司),真空冷冻干燥机/冻干机(LGJ-30FD,北京松源华兴科技发展有限公司),制备级HPLC(P3000Ⅰ型，北京创新通恒色谱技术有限公司),岛津LC-MS[LCMS2020,津纳仪器设备(上海)有限公司],岛津HPLC分析[LC-10AT 2010A,津纳仪器设备(上海)有限公司],中试型EDI连续电去离子超纯水机(YL-EDI60,上海弋澜环保科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 DOTA-G3NGR的合成

(1)选用 25 mL的反应器，并在反应器上写明多肽名称作为标记。 用电子天平称取 2-Cl-Trt树脂 500 mg, 放入反应器中，加入DCM 浸泡30分钟，然后用 DMF洗3遍，DCM 洗1遍。

(2)称取0.15 mmol的Fmoc- CYS(TRT)-OH加入离心管中，并加入8 mL无水DCM和800 μL DIEA,摇匀。用移液枪吸取溶液加入到上一步的反应器中，氮气鼓泡反应 1.5 h, 反应结束用DMF 洗涤树脂3次，用加0.5 mL DIEA,0.5 mL甲醇，2 mL DCM的混合液，反应 20 min。

(3)洗涤：用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干后，用洗瓶向反应器中加入 DMF,试剂体积约占树脂体积的3倍，洗涤30 s, 然后用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干，重复该操作4次。

(4)脱Fmoc: 用洗瓶加入 20%哌啶/DMF溶液至反应器中，试剂体积约占树脂体积的3倍，使树脂完全被溶液浸泡，氮气鼓泡反应20 min。

(5)洗涤：用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干后，用洗瓶向反应器中加入DMF,试剂体积约占树脂体积的3倍，洗涤30 s, 然后用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干，重复该操作4次。

(6)树脂检测：用长颈吸管取反应器中树脂 10～20 颗置于检测管底部，接着用胶头滴管各取两滴检测试剂 A、B 滴入试管中，使树脂与检测试剂能够充分接触，然后将试管放入 100 ℃恒温加热 2 min, 观察树脂颜色，树脂显色即表示脱 Fmoc 成功；若不显色，重复4～5操作。

(7)缩合(Coupling):称取 0.5 mmol Fmoc-ARG(PBF)-OH 和0.5 mmol HOBT(0.075 g)于离心管中，用1 mL DMF 充分溶解后；再加入 100 μL DIC,混合 1 min, 加入到抽干后的树脂中，氮气鼓泡反应 1 h。

(8)树脂检测：参照6操作，观察树脂颜色，如果无色表明连接完全，进行9操作；若有颜色重复7操作。

(9)洗涤：用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干后，用洗瓶向反应器中加入DMF,试剂体积约占树脂体积的3倍，洗涤30 s, 然后用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干，重复该操作4次。

(10)重复4～9操作，直到多肽合成结束。

(11)最后脱除 Fmoc(参照4操作),之后进行洗涤(参照5操作),再用加 0.3 mmol DOTA-NHS,2 mL DMF,再加入 100 μL DIEA 反应 20 min 使多肽 N 端修饰DOTA;然后用甲醇按照洗涤方法洗涤树脂 3 次，最后用循环水式真空泵将反应器内的液体抽干，真空干燥至树脂呈颗粒状。

(12)从树脂上切割多肽：切割试剂的配制(100 mL)95 mL TFA+1 mL 水+2 mL EDT+2 mL Tis, 备用；甲基叔丁基醚置于-20 ℃低温预冷，1 mL切割试剂用10 mL甲基叔丁基醚洗涤；多肽的切割：抽干后的树脂后进行称重，加入切割液切割 2 h。 然后用甲基叔丁基醚沉降。

(13)多肽纯化：色谱柱： 30*250 mm diagesol 8 微米；流动相：A:0.1%TFA 水；B:0.1%TFA 乙腈；流速：12 mL/min, 将样品经 A 泵上样，然后运行 10%的乙腈水平衡 5 min 开始运行梯度，制备收集检测的样品峰，分析纯度大于80%,将样品冻干。

1.3.2 DOTA-G3NGR的标记及体内外稳定性检测

取新鲜淋洗的99TcmO4- 10 mCi (37 MBq),氯化亚锡(SnCl2)10 μg, 逐滴加入溶于去离子水的1 mg DOTA-G3NGR中，充分混匀，在38 ℃水浴箱中振荡反应30分钟；将反应液移入5 mL透析管中，在室温下振荡透析30分钟(透析液为500 mL去离子水),收集5管含99TcmO4- 透析液，每管1 mL,测定每管的放射性活度取平均值，然后换算成放射性浓度，最后推算出透析液中总的放射性活度，根据公式：

计算出DOTA-G3NGR 的99Tcm标记率。

体外及体内稳定性检测：取新鲜标记好的99Tcm-DOTA-G3NGR 1 mCi (3.7 MBq)加入5 mL 0.9%NS(或胎牛血清5 mL)中，摇匀后静置于室温下或37 ℃,5%CO2孵箱中，分别于1、2、4及6 h以HPLC检测放射化学纯度。

1.3.3 细胞培养及小鼠模型的建立

(1)HT1080细胞培养于DMEM培养基，HT29细胞培养于RM1570培养基。培养基含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素。细胞培养在37 ℃,饱和湿度，5%CO2浓度的培养箱中，待细胞浓度达到80%左右进行传代。

(2)BALB/c 裸鼠8周龄，雌雄各半，共10只，体重25g/只左右，饲养于无特殊病原体(SPF)级环境中。垫料经紫外线消毒，小鼠饲料及饮用水均经高压灭菌处理。

(3) 收集HT-29和 HT-1080 细胞以5×106 /只接种于小鼠右侧腋下，继续饲养，待肿瘤生长至1 cm左右时行SPECT显像。

1.3.4 小鼠模型SPECT显像

第一次显像：通过腹腔注射99Tcm-DOTA-G3NGR(200 μCi/只)后，分别于0.5、2、4及6 h, 将小鼠固定于平整的木板上，行SPECT静态显像(Siemens Symbia T16)。采集条件：Matrix: 256×256,zoom: 1.67,能峰：140 keV,窗宽：20%,采集计数300 k。图像处理：采用感兴趣区技术(regin of interest, ROI),选择肿瘤作为靶组织(target, T),对侧肌肉组织作为非靶组织(nontarget, NT),统计ROI区域内的总放射性计数计算T/NT比值。第二像：在第一次显像后，小鼠继续饲养于SPF级环境中7天，每天按0.5 mg/kg腹腔注射血管靶向药(乌本美司，北京百奥莱博科技有限公司),于第8天按第一次显像方法再次进行SPECT显像。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0软件对上述获得的结果进行统计和分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差

来表示。多个样本间的比较采用Oneway ANOVA,方差齐，用LSD法；方差不齐，用邓尼特T3法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 DOTA-G3NGR合成情况

DOTA-G3NGR在色谱柱中(300 mV,214 nm)平均滞留时间在15 min(图1),纯化后其纯度可达95%以上；质谱分析结果显示，DOTA-G3NGR实际分子量为1 107.20,与理论分子量1 107.18很接近(图2),表明通过该法所合成的DOTA-G3NGR对结构及分子量基本上没有影响。

图1 DOTA-G3NGR HPLC 分析纯化结果   

图2 DOTA-G3NGR质谱分析结果  

2.2 DOTA-G3NGR的标记及SPECT显像

经HPLP纯化后99Tcm-DOTA-G3NGR的标记率达85%,放射化学纯度(radiochemical purity, RCP)达95%以上(97.30±0.76)%(n=4)。经室温和37 ℃,10%FBS,5%CO2条件下，分均在90%以上(图3),经腹腔注射后HT-1080 移植瘤放射浓聚明显高于HT-29移植瘤和HT-1080移植瘤抗血管生 成治疗后1周(图4);最大T/NT值可达 4.23±0.53,且高峰时间出现在注射后4小时，而HT-29移植瘤T/NT值约1.20±0.15,且无明显峰值(图5)。通过抗血管生成治疗后7天，再注射99Tcm-DOTA-G3NGR显像时HT-1080移植瘤T/NT值出现明显的降低，而HT-29移植瘤T/NT比值无明显变化。统计学分析结果显示：HT-1080移植瘤及抗血管生成治疗后1周的HT-1080移植瘤摄取99Tcm-DOTA-G3NGR的T/NT值均明显高于HT-29移植瘤(P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.030 6)(图5)。

图3 99Tcm-DOTA-G3NGR的体内外稳定性检测结果   

图4 荷瘤小鼠SPECT移植瘤(箭头所示)显像结果   

3、讨论

肽键的形成是氨基在羧基上的亲核取代反应，涉及一个四面体中间体，然而，在室温下，羧酸与氨或胺的反应产物是铵盐而不是酰胺。因此，羧基组分必须在肽键形成前活化。此外，肽缩合反应必须在温和的反应条件和室温下进行。目前，形成肽键最常用的方法是碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯法、迭氮物法等。活化酯的优点在于所用的N-保护氨基酸活化酯很多都能分离纯化出来得到结晶的纯品，而且比较稳定，能够放置保存。本研究采用活化酯法合成DOTA-G3NGR在纯度及产额上与文献报道基本相符[5,6],且反应条件相对要求不高，可操作性好。

图5 注射后不同时间小鼠移植瘤T/NT统计(n=5)   

氨基肽酶N(CD13)作为一种多功能的膜结合金属蛋白酶，研究表明，该酶在血管生成中表达上调，而在正常血管中几乎不表达(或根本不表达)[7],因此，以CD13作为靶点的血管生成显像受到国内外学者的广泛关注并取得了令人欣慰的结果[8,9]。研究表明，CD13在许多实体肿瘤的血管中表达上调，并根据肿瘤类型的不同，可以观察到癌细胞、间质和/或脉管系统的表达[10],而在人结肠癌细胞HT-29中不表达[11],本实验研究结果显示，HT-29荷瘤小鼠T/NT接近于正常组织也印证了这一结论，从T/NT时间变化曲线上看，T/NT略高于正常组织的原因是肿瘤可能伴随有一定的非特异性摄取。

与正电子影像相比，单光子图像虽然在图像分辨率方面具有一定的劣势，但单光子影像费用相对较低、易于操作及放射防护，因此易于在具有SPECT设备的医院开展。国内外学者报道了以99Tcm标记单体和二聚体NGR[12]及NGR-chlorambucil[13]用于肿瘤血管生成和靶向治疗的实验，并取得了成功，为 99Tcm标记NGR在肿瘤靶向显像及以NGR作为载体进行肿瘤靶向治疗提供了重要的文献支持。本实验利用99Tcm-DOTA-G3NGR对荷瘤小鼠在接受抗血管生成治疗前后分别进行SPECT显像，结果显示在接受靶向治疗后1周，肿瘤的T/NT值较治疗前明显降低，提示该探针具有较好的靶向CD13特性及抗血管生成药物早期已经对HT-1080移植瘤CD13表达产生了抑制效果，具有一定的临床应用潜力，但仍需要进行不同肿瘤模型的实验进行进一步的研究。

血管生成是肿瘤细胞生长和转移的关键。肿瘤血管生成是指新的毛细血管从原有的血管系统中分支出来，形成一个完善的血管网络，维持肿瘤内适当和不受限制的营养和氧气稳态。这是一个多步骤的过程，启动血管生成开关的激活，刺激促血管生成调节因子并抑制抗血管生成调节因子[3,14,15]。由于血管生成是癌症的一个重要标志，针对血管生成的分子决定因素的治疗靶向性已经得到了发展[16,17]。然而，针对血管靶向药物的疗效评价目前尚缺乏直观的影像学方法，但可喜的是国内外研究人员已经做了大量的基础实验或临床前期研究[18,19,20]。这些研究为评价抗肿瘤血管生成提供了大量的基础或前期临床数据参考。本研究结果显示，HT-1080移植瘤在接受抗血管生成治疗后其T/NT比值仍大于HT-29移植瘤，可能原因是HT-1080移植瘤CD13表达并未完全受抑制有关。

本研究的局限性在于仅使用了已确定的CD13阳性细胞系作为研究对象，没有对更多的抗血管生成靶向药物进行实验，此外本实验仅做了动物SPECT在抗血管生成治疗前和治疗后一周的SPECT显像，因此进一步研究需要进行不同类型实体肿瘤的模型研究及CD13在治疗前后表达情况的免疫组织化学或蛋白表达检测，以为该法的临床前试验提供更多的数据支持。

综上：本实验通过活化酯法合成DOTA-G3NGR,并制备了在体内均具有较好稳定性的99Tcm-DOTA-G3NGR,通过建立CD13阳性表达的荷瘤小鼠肿瘤模型并分别在应用抗血管生成前后成功进行了SPECT显像，为进一步早期评价抗肿瘤血管生成疗效方面的研究提供了一种直观的影像学方法。

参考文献:

[16]马玉倩,邢晓燕,葛彬彬,等.APN/CD13抑制剂乌苯美司:一个抗肿瘤化疗药物分子伴侣[J].中国药理学通报,2021,37(11):1497-1502.

[17]黄小鹰,许小林,陈海萍,等.华蟾素联合乌苯美司治疗中晚期原发性肝癌30例疗效观察[J].药品评价,2020,17(16):62-64.

基金资助:贵州省基础研究计划(自然科学类)项目(编号:黔科合基础[2019]1325号);

文章来源:刘松松,邱懋灵,熊玲等.99Tcm-DOTA-G3NGR SPECT显像靶向评价抗血管生成药物早期疗效的初步实验研究[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4514-4519.