肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的预防、早期监测或诊断，仍是亟需解决的医学界难题[1]。HCC病原学因素主要与肝炎病毒感染(HBV或HCV),化学致癌物摄入及快速增长的代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD)等有关[2-3]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)或其亚组分(AFP-L3)有助于HCC高危人群的筛查，然而临床发现约有40%患者AFP处于正常范围，早期监测价值有限[3]。新的GALAD评分模型(gender, age, AFP-L3,AFP和des-γ-carboxyl prothrombin)[4],已用于肝硬化、慢性肝病和非酒精性脂肪性肝炎中肝癌早期检测[5-6]。肝细胞恶性转化时，相关通路如胚胎期基因异常转录、抑癌基因失活或促癌基因激活等的信号分子异常表达并释放至血中，为癌变早期监测、免疫治疗或靶向干预奠定基础[7-8]。近年，新报道的高迁移率族蛋白3 (high mobility group box 3,HMGB3)、Wnt/β-catenin通路中Wnt3a、分泌型簇蛋白(secretory cluster protein, sCLU)、血管生成素-2 (angiopoietin-2,Ang-2)、高尔基蛋白73 (Golgi protein 73,GP73)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3,GPC-3)等信号分子异常，与慢性肝病的恶性转化密切相关。本文述评了肝细胞恶性转化过程中癌胚性信号分子变化、动态模型验证及其早期监测价值。

1、肝细胞恶性转化的信号级联

良性肝病进展到肝细胞恶性转化的癌前环境中，炎症细胞释放广泛的细胞因子、趋化因子、生长因子、前列腺素和促血管生成因子，使组织环境更适合细胞从获得性基因突变开始恶性转化[9]。转录因子(NF-κB、STAT-3),促炎因子(IL-6、TNF-α),抗炎因子(TGF-β),促血管生成因子(Ang-2、VEGF),细胞因子，免疫细胞及信号通路参与细胞的恶性转化[10]。癌基因Myc为一种主要致癌转录因子，在肝生理和慢性肝病恶性转化中调控细胞增殖、新陈代谢和免疫逃避靶基因、癌细胞转移、去分化、代谢、免疫微环境和多药耐药(multi-drug resistance, MDR)形成[11]。在细胞恶性转化或癌变细胞增殖或代谢过程中大量耗氧，在组织缺氧微环境下缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)激活，成为新血管生成的关键调节因子[12]。肝癌发病机制中一个关键信号级联是Janus激酶及信号转导和转录激活因子通路，与其众多上游激活因子(如炎症介质和细胞因子)间动态相互作用，持续激活致细胞转化包括不受控制的细胞增殖，发生细胞凋亡或免疫监测逃逸[13],肝细胞恶性转化是多方面、多步骤的复杂过程，涉及多种信号通路及其信号级联。

转录组学动态模型验证了上述，作者基于发明专利(ZL201810077848.2),以致癌物2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, 2-AAF)建立肝细胞恶性转化模型。经肝病理组织学(HE染色)证实分为肝细胞变性(hepatocyte degeneration, HD)、癌前病变(precanceration, PC)、HCC和正常对照(normal control, NC)四个阶段，观察相关信号分子级联。与NC组相比，在HD阶段上调或下调差异表达基因(differential expressed genes, DEGs)数目分别为70个或93个，主要基因包括氧化还原酶、酸性巯基酶活性、多肽抗原、辅因子结合、内质网和内质网膜；在PC阶段有1 015个或437个DEGs,如生长因子、钙依赖性磷脂、同源蛋白、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)结合、氧化还原酶、酸巯基酶、着丝粒区微管细胞骨架、质膜、细胞外和纺锤体为主要成分；在癌变阶段有1 234个或504个DEGs,如有机钠转运蛋白、微管运动、蛋白二聚化活性、同源蛋白、钙离子和细胞骨架蛋白分别与胞外部分、微管细胞骨架、质膜和细胞成分结合[14],提示异常信号不仅有助于探讨癌变机制，也为监测及靶向干预奠定基础。

2、HMGB3信号分子

人类高迁移率蛋白超家族(high mobility group, HMG)包括HMGA、HMGB和HMGN家族。HMGB家族由HMGB1、HMGB2、HMGB3和HMGB4组成，编码含有一个或多个DNA结合蛋白质，其功能涉及细胞分化，迁移和炎症相关活动[15]。对HBV相关HCC组织和慢性肝病患者血清HMGB3表达分析，首次发现HCC组织HMGB3表达，显著高于自身对照的癌周组织，且与瘤体大小、TNM分期、高复发率密切相关，与患者年龄、性别、AFP、HBV感染和肝硬化未见统计学差异。队列研究慢性肝病患者分析，显示良性慢性肝炎进展到HCC过程中，血HMGB3水平呈升高趋势。临床上，比较分析诊断HCC敏感性，HMGB3为75.6%,AFP为56.7%,联检为89.0%;对<3 cm肝癌诊断阳性率，HMGB3为55.3%,AFP为39.5%,联检升至71.1%[16],提示HMGB3有助于良、恶性肝病的诊断和鉴别诊断，为促进肝细胞恶性转化的早期标志物。

为了证实HMGB3是否对肝细胞恶性转化具有早期监测价值，利用上述动态模型进行了验证，在NC、HD、PC和HCC四组中，qRT-PCR显示，HMGB3 mRNA在肝细胞恶性转化过程中呈进行性上升表达，除NC组无表达外，HD组半数异常，PC组和HCC组全数异常；IHC显示HMGB3呈进行性梯度表达，与肝组织病理学和HMGB3 mRNA改变一致，呈显著正相关；定量检测肝组织HMGB3比浓度和血HMGB3水平，呈平行同步上调表达，也呈显著正相关。从组织、基因转录和蛋白分析，无论蛋白水平还是mRNA转录，均证实HMGB3表达与肝细胞恶性转化密切相关[17-19],经Wnt/β-连环蛋白、ERK/c-Myc、NF-κB信号通路，晚期糖基化终末产物受体轴，上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和活化caspase-1等发挥作用，调控癌相关基因转录和细胞周期改变，为监测肝细胞恶性转化的信号分子。

3、Ang-2信号分子

新血管生成涉及多种病理过程，取决于内皮细胞增殖和组织氧浓度等复杂过程。细胞恶性转化或癌细胞无限制增殖时耗氧，极易形成缺氧微环境[20]。HIF-1α作为关键调节因子大量表达，激活Ang-2及配体、受体和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)介导通路，调节新血管生成、成熟或稳定。HCC是典型的高血管性恶性肿瘤，Ang-2可增强癌细胞增殖和抗凋亡能力，促进癌细胞转移[21]。临床上已证明Ang-2是慢性HBV、HCV、MASLD和HCC血管生成的关键驱动因素[22]。慢性肝病(HCC、慢性肝炎和肝硬化)患者血清Ang-2水平，显著高于NC组(P<0.001)。Ang-2阳性率(>35μg/L),HCC组为90.0%,肝硬化组为6.0%,慢性肝炎组为4.0%,NC组未见阳性。肝癌患者过表达Ang-2,其临床病理特征与瘤体大小(≥5 cm)、分化程度差、多灶、AFP(≥50μg/L)、肝硬化、HBV感染、门静脉浸润或淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.001);另Ang-2与VEGF、HIF-1α呈显著正相关(P<0.001),提示良性肝病进展到HCC过程中Ang-2上调表达，异常水平与肝细胞恶性转化有关[23]。

肝细胞动态转化模型验证了Ang-2的早期监测价值。恶性转化模型中HD、PC和HCC各阶段与NC组相比，在上调DEGs中均包括Ang-2。从正常肝细胞到肝细胞损伤，早期癌变至HCC形成过程中，定量检测Ang-2 mRNA、Ang-2比浓度或血清Ang-2水平，均显示呈动态上调表达；在缺氧微环境中，肝组织加速新血管生成以满足癌变细胞的氧需要，提示异常的Ang-2信号有助于监测慢性肝病恶性转化[24-25]。

4、Wnt3a信号分子

肝细胞恶性转化主要与Wnt/β-连环蛋白信号异常激活有关[26]。活化Wnt信号分子经 β-连环蛋白依赖的经典或非经典通路调节细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为。在19种Wnt蛋白家族成员中，Wnt3a基因位于17号染色体(17q21),激活后诱导胞内 β-连环蛋白积聚。在HBV慢性肝病中，Wnt3a可激活HBx和Src激酶，抑制GSK3使胞内β-连环蛋白积累，活化DNA甲基转移酶I,结合并沉默分泌型卷曲相关蛋白1和5;HBx降低去乙酰化酶1对 β-连环蛋白抑制，促进细胞恶性转化[27-28]。慢性HCV肝病患者中，病毒核心蛋白活化Wnt3a,诱导T细胞转录因子4(transcription factor T cell factor 4,TCF4)依赖性转录，抑制糖元合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)和稳定 β-连环蛋白核运输，上调细胞周期素D1、c-Myc、Wnt1诱导信号通道蛋白2(Wnt1 inducible signaling pathway protein 2,WISP2)、Wnt3a、Wnt1和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)表达，以促进HCC细胞增殖或加速DNA合成促进HCC进展[20, 29-30]。

临床调查首次发现HCC患者Wnt3a过高表达[31]。免疫组化分析癌组织Wnt3a,其表达率高达96.3%,明显高于自身对照癌旁组织；Wnt3a表达随临床分期逐渐增强，晚期肝癌尤其明显。癌组织Wnt3a呈显著高表达，其临床病理特征与低分化程度、伴肝硬化、HBV感染、淋巴结转移和患者5年生存率显著相关。在慢性肝病患者中血清Wnt3a水平，92.5%的肝癌患者表达异常，显著高于良性肝病组，与患者AFP浓度、伴肝硬化、HBV感染、低分化程度、伴淋巴结或肝外转移显著相关。当Wnt3a>800 ng/L时，诊断肝癌特异性为94.3%,AUC为0.994,优于同组AFP的0.698和0.710,显示Wnt3a表达与肝癌发生相关，是肝癌早期诊断特异标志物[32]。

动态模型验证，Wnt3a对HCC发生具有监测价值。按照HE染色分期，经肝转录组学分析DEGs显著改变，主要涉及细胞增殖、信号转导、肿瘤转移和细胞凋亡基因。与NC期比较，Wnt3a mRNA呈显著上调表达(P<0.001),在肝细胞损伤期上调4.6倍，癌前病变期上调7.4倍，癌变期上调10.4倍；经IHC证实肝Wnt3a显著表达(P<0.001),肝损伤期阳性率66.7%、癌前期100%和癌变期100%;定量分析证实血清Wnt3a与肝组织Wnt3a呈同步进行性上调表达，均提示无论在mRNA或蛋白水平，Wnt3a异常有助于监测肝细胞的恶性转化[14]。

5、GPC-3信号分子

HCC早期特异性诊断和有效治疗至关重要。GPC-3通常存在于胎肝，为锚定在HCC细胞膜上的癌胚蛋白多糖，健康成人肝中不能检出。位于Wnt/β-连环蛋白通路上游的GPC-3,调控Wnt/β-连环蛋白通路或与多种信号分子级联，促进细胞恶性转化[33-34]。在肝细胞恶性转化、增殖、转移或侵袭中发挥功能。临床调查显示肝癌组织无论在GPC-3基因转录或蛋白水平均异常表达，其临床病理学特征与HBV感染、门静脉栓塞或肝外转移和生存率显著相关。血液中GPC-3仅见HCC患者，阳性率在50%左右，低于AFP,然而诊断特异性为95%左右，明显优于AFP[35]。在机制上，GPC-3在肝细胞恶性转化过程中，通过与Wnt/β-连环蛋白信号通路或生长因子等结合发挥作用，体内外有研究证实靶向GPC-3可抑制HCC生长[36]。

以雄性SD大鼠诱发肝细胞恶性转化的动态模型证实[35],病理组织学(HE染色)、GPC-3 mRNA的RT-PCR扩增和肝组织与血液GPC-3定量分析，显示GPC-3阳性表现为胞浆内棕色颗粒样信号，在肝组织病理组织学确诊的HD、PC和HCC三个阶段，GPC-3 mRNA、GPC-3及血GPC-3阳性率，在HD组分别为83.3%、83.3%和38.9%,PC组分别为100%、100%和66.7%,HCC组分别为100%、100%和77.8%,NC组中未检出GPC-3。肝GPC-3 mRNA与总RNA水平(r=0.475,P<0.05)、与肝GPC-3(r=1.0,P<0.001),与血清GPC-3(r=0.994,P<0.001)均呈正相关，提示转录水平的GPC-3 mRNA或蛋白水平的GPC-3异常，均有助于监测肝细胞的恶性转化[37]。

6、GP73信号分子

定位于人类基因9q21.33的高尔基体蛋白73(GP73或GOLPH2),其GP73 mRNA约3.0 kb,肝细胞表达的GP73为高尔基体特殊的Ⅱ型跨膜糖蛋白，免疫介导慢性肝病，在细胞损伤或病毒复制时，表达增加以促组织再生或肝病进展[38]。GP73增强甾醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins, SREBPs)-SREBP切割激活蛋白(SREBP cleaves activating proteins, SCAP)作用，调节脂变性激活TGF-β1/Smad2信号与MDR发生[39]。肝癌组织表达过GP73并分泌至血中，IHC分析显示癌组织GP73表达明显高于癌旁组织，其阳性率在Ⅰ期为53.3%,Ⅱ期为84.0%,Ⅲ期为84.6%,Ⅳ期为60.0%。肝病患者GP73过表达与HBV感染、肝纤维化和肝硬化分期一致，良、恶性肝病间存在显著差异[40]。高水平GP73出现在肝癌患者血中，其诊断灵敏度高于其他标志物，且与HCC转移、复发及预后差等密切相关。肝癌患者血清GP73水平显著高于肝硬化或肝炎患者，为HCC的诊断和预后标志物[41-42]。

为澄清GP73作为早期筛查标志物的临床价值，用含2-AAF饲料制作肝细胞恶性转化动物模型，分别观察了肝细胞在恶性转化过程中GP73和GP73 mRNA动态变化。模型显示GP73和GP73 mRNA在NC鼠肝中几乎无表达；在HD组中，分别为66.7%和44.4%,在PC组中，分别为88.9%和77.8%,在HCC组中均为全数(100%)表达，且肝组织和血清GP73呈正相关(r=0.91,P<0.01)[43],提示在蛋白或转录水平上GP73过表达，均是肝细胞恶性转化敏感而有价值的监测标志物。

7、NF-κB信号分子

作为炎症介质的NF-κB,肝细胞炎症时最早期被激活，具有桥接生长因子作用。NF-κB在核移位后与相关基因启动子结合发挥调节功能，介导肝细胞恶性转化[44]。NF-κB连接多条信号通路活化，促进癌细胞增殖和抑制凋亡，上调基质金属蛋白酶和EMT,诱导新血管生成，增强侵袭能力[45]。肝癌组织NF-κB mRNA和NF-κB呈过表达状态，与P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)表达与MDR形成密切相关。以特异性siRNA抑制NF-κB转录，同时下调P-gp表达使癌细胞对阿霉素化疗敏感。另发现二甲双胍和NF-κB siRNA,在抑制癌细胞增殖、细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡方面具有协同作用，下调MDR1/P-gp可逆转癌细胞MDR[46],标明肝细胞炎症紧密联系的NF-κB激活是HCC发展早期的关键事件[47]。

定量分析动物验证模型HCC不同发展阶段胞内NF-κB表达水平，显示肝细胞在早期表现为液泡样变性，中期表现为增生性淋巴结，后期进展为高分化癌巢结节。IHC显示NF-κB阳性呈浅黄色，细颗粒定位于细胞核内。NF-κB阳性细胞比率，在HD组为81.8%,在PC组为83.3%,在HCC组为100%,均显著高于对照组；另肝细胞恶性转化过程中，肝内NF-κB和NF-κB mRNA表达均明显增高[46];同样，诱癌过程中以灌胃方式给予沙利度胺(100 mg/kg体质量)干预NF-κB活化，在肝细胞形态学上的改变，仅早期或中期产生点状变性和坏死，在终末期产生结节性增生或少量非典型增生，NF-κB和VEGF表达低，表明干预NF-κB活化，可延缓肝细胞的恶性转化发生[48]。

8、展望

总之，HCC发生率仍居高不下且预后不佳，尚缺乏有效早期诊断及预后指标。因为HCC发生起病隐匿，早期症状不明显而难以被发现，多数患者确诊时已呈现多发病灶或合并转移。肝细胞恶性转化伴有多种相关信号通路激活、DNA甲基化或非编码RNA调控等密不可分，尤其关键信号分子异常不仅有助于探讨癌变复杂机制，可在高危人群中监测或早期发现HCC迫在眉睫，为患者赢得治疗时间；也可针对特异信号分子研发靶向治疗技术，结合手术、介入、放疗和化疗等，以改善患者疗效并延长生存时间。随着组学、分子病理学、药理学和基因工程、DNA剪接、基因沉默、干扰转录和单克隆抗体技术等迅速进展，使免疫治疗更特异，不良反应更小，直接阻断相关信号分子，或作为放射性核素、药物载体和治疗靶点，在HCC有效干预或综合性治疗中发挥独特作用。

基金资助:国家自然科学基金项目(81673241);南通市传染病防治联盟基金(202308001);

文章来源:谢群,唐昊,徐敏,等.癌胚型信号分子在监测肝细胞恶性转化中的临床价值[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(12):1711-1715.