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构建癌基因C-jun与其缺失突变体过表达细胞株及鉴定研究

2020-07-08 544 上传者：管理员

摘要：为了探究转录因子C-jun在细胞中的生理功能，以真核细胞表达质粒pFlag-c-jun为模板，首先设计了C-jun DNA结合功能域缺失突变体的点突变引物序列，构建Flag-C-jun DNA结合功能域缺失突变体质粒pFlag-c-junmut.通过细胞转染、药物筛选等方法，获得Flag-C-jun和Flag-C-junmut稳定表达的HelaS细胞株，用蛋白印记迹交和细胞免疫荧光染色方法对细胞株进行验证.鉴定结果表明，本研究成功构建了Flag-C-jun和Flag-C-junmut稳定表达的细胞株，且表达均在细胞核内.

关键词：
C-jun
稳定表达
细胞株
缺失突变体
肿瘤实验研究
转录因子
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转录因子C-jun基因作为原癌基因，在多种癌变器官中呈现高表达，如肺癌、宫颈癌、乳腺癌[1,2,3,4]等.C-jun在子宫内膜癌中的表达量也较高，并且能够与类固醇生成因子1和肝脏受体同源物1结合促进子宫内膜癌的增殖.研究[5,6]表明，C-jun的表达水平与患者临床病理特征和预后密切相关，预示着C-jun可作为肿瘤发生发展的重要指标.

C-jun全长331个氨基酸，包括两大功能域：转录因子激活功能域和亮氨酸拉链bZIP功能域（含DNA结合功能域），属于Jun家族蛋白.Jun家族成员主要包括C-Jun、Jun B和Jun D.Jun家族可与Fos家族（包括C-Fos、Fos B、Fra1和Fra2）通过亮氨酸拉链b ZIP结构组成二聚体，其中最为稳定的转录因子二聚体AP-1就是由C-jun和C-Fos聚合而成[1].C-jun在细胞中参与调控细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程[7]，它主要通过行使自身的转录功能来调控多种蛋白的表达，进而完成对细胞生理过程的调节.当它发挥转录功能时，C-jun氨基端激酶（JNK）对C-jun的N端进行磷酸化，使其能够二聚化形成同型或异型二聚体[1]，并增强其二聚体的稳定性，进而促进转录[8].C-jun在细胞中能够转录WT1[9,10]、Keratin 5[11,12]、Id2A[13,14]等多种与细胞生理活动相关的蛋白.其中，C-jun通过转录WT1，使得WT1在有丝分裂时期与MAD2、BUBR1等结合，从而抑制细胞有丝分裂后期促进复合物APC(anaphase promoting complex）对Cyclin B1的降解作用[10].因此，C-jun对于细胞的正常生长分裂具有重要意义.

C-jun作为一个重要的转录因子，其下游靶基因已见文献报导，这些基因都参与细胞分化[15]、增殖[10]、凋亡[16]等重要生命过程.本研究通过细胞转染、点突变、药物筛选等方法，获得Flag-C-jun和Flag-C-junmut稳定表达的HelaS细胞株，并用蛋白印记杂交和细胞免疫荧光染色方法对细胞株进行验证，为进一步筛选转录因子C-jun的下游靶基因，研究其调控细胞生命活动的作用机制奠定实验基础.

1、材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1质粒和细胞

pFlag-c-jun表达质粒，购于优宝生物公司；HelaS细胞，由天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室提供.

1.1.2主要试剂和工具酶

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Phanta Max超保真DNA聚合酶），美国Vazyme公司；BamH1、Xho1限制性内切酶、转染试剂Turbofect，美国Thermo Scientific公司；琼脂糖（REGULAR AGAROSE G-10），法国BIOWESTE公司；Gelred，美国Biotium公司；DMEM细胞培养基，以色列Biological Industries公司；FBS，美国HyClone公司；G418，北京索莱宝科技有限公司；Opti-MEM培养基，美国Gibico公司；Super DNA Marker，北京康为世纪生物科技有限公司.

1.2方法

1.2.1 Flag-C-jun DNA结合功能域缺失突变体质粒的引物序列设计

以NCBI上提供的C-jun c DNA参考序列（NM＿002228）作为模板，根据其DNA结合功能域位置设计点突变PCR引物，引物序列如表1所示，引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成.

表1 p Flag-C-jun DNA结合功能域缺失突变体质粒引物设计

1.2.2点突变

以pFlag-c-jun质粒为模板，加入Phanta Max超保真DNA聚合酶、dNTP、引物、buffer进行PCR扩增.PCR扩增程序如下：95℃30 s预变性，95℃30 s变性，64℃1 min退火，72℃7 min延伸，16个循环；72℃10 min终延伸，4℃保存.得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，验证无杂带后用Dpn I酶切1 h（水浴37℃），再次DNA电泳验证无误后，将PCR产物转入感受态细胞进行扩增，所得质粒送至生物公司测序，验证无误后获得突变体质粒.

1.2.3质粒转染

用含10%FBS的DMEM培养HelaS细胞.将HelaS细胞接种于24孔板中，每孔3×104个细胞，24 h后将配制好的转染试剂（每孔含质粒250 ng、Turbofect0.5μL、Opti-MEM 100μL）边摇边加至24孔板中，放入细胞培养箱（CO2体积分数为5%,37℃）中培养24～48 h.

1.2.4稳筛细胞株的构建

将HelaS细胞接种于24孔板中，每孔细胞数量为3×104个，铺4个孔.其中，空白对照和转染pFlag-c-jun或pFlag-c-junmut质粒各2个孔，48 h后从空白对照和质粒转染的细胞中各取一孔做Western blot，测定Flag-C-jun蛋白表达.将另一孔中的细胞（对照细胞和转染后的细胞）用胰酶消化后转至10 cm平板使细胞分散开，用含有750 ng/μL G418的DMEM进行培养.5 d后换液，直至细胞形成单克隆.挑取细胞克隆至24孔板进行培养.细胞正常生长后，取1/2细胞进行Western blot检测是否有Flag-C-jun或Flag-C-junmut的表达，将能够表达Flag-C-jun或Flag-C-junmut的细胞转至10 cm平板进行正常细胞传代培养.

1.2.5蛋白质印迹杂交

用配制的SDS裂解液收集细胞，得到全细胞裂解液后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，再通过半干型转印电泳槽将蛋白转至PVDF膜，转膜1 h.脱脂奶粉封闭0.5 h，一抗室温孵育2 h(Mαtubulin,RT 2 h;MαFlag,RT 2 h),TBST洗3次，二抗室温孵育1 h(Gαmouse HRP），加入ECL和过氧化氢后曝光.

1.2.6细胞免疫荧光染色

细胞计数后，在细胞爬片上每孔铺3×104个细胞，待密度大约为80%～90%时取出爬片，PBS洗3次，用甲醇-丙酮固定液固定5 min，再次用PBS清洗3次.用山羊血清配成的封闭液封闭0.5 h，用0.1%PBS-TX洗3次.加入0.1%PBS-TX稀释的一抗稀释液，室温孵育2 h(MαFlag,RT 2h).PBS-TX洗3次，加入0.1%PBS-TX稀释的二抗稀释液，室温避光孵育1 h.二抗结束后，加入0.1%PBS-TX稀释的DAPI,0.1%PBS-TX洗3次后加入抗荧光猝灭剂，用指甲油将细胞爬片的周围密封，置于荧光显微镜下观察.

2、结果与分析

2.1真核细胞表达质粒p Flag-c-jun的酶切鉴定

p Flag-c-jun质粒全长6 445 bp，其中c-jun的c D NA全长为996 bp.根据图1的质粒图谱可以看出，pFlag-c-jun质粒经BamH1和Xho1双酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳能够看到一条约为1 005 bp的条带，与目的基因的长度大致相符，同时还有一条长度约为5 440 bp的条带，与载体片段大小一致，因此酶切验证该质粒正确.

2.2构建Flag-c-jun DNA结合功能域缺失突变体质粒pFlag-c-junmut

根据NCBI上查找到的C-jun的DNA结合功能域（图2），通过点突变的方式将该区域去除，琼脂糖凝胶电泳验证后（图3），用获得的质粒转化感受态细菌.将生长的单克隆细菌小量扩增后小提质粒，送至生物公司测序.通过比对测序结果可以得知，本研究已成功将C-jun DNA结合功能域去除（图4).

图1质粒p Flag-c-jun的酶切鉴定结果

图2 C-jun的氨基酸序列

图3 p Flag-c-junmut点突变琼脂糖凝胶电泳结果

图4 p Flag-c-junmut点突变测序结果比对

2.3 Flag-C-jun和Flag-C-junmut稳定表达细胞株的构建

成功得到真核细胞表达质粒pFlag-c-jun和pFlag-c-junmut后，构建能够稳定表达Flag-C-jun和Flag-C-junmut的稳筛细胞株.分别转染pFlag-c-jun和pFlag-c-junmut质粒，48 h后收集细胞进行Western blot，结果如图5所示.由图5可以看出，2个质粒在转染48 h后均有表达.随后用含有G418的培养液继续培养，挑取单克隆移至24孔板后，收集部分细胞进行蛋白表达检测，以瞬时转染的p Flag-c-jun和p Flag-c-junmut作为对照，直至选出能够稳定表达Flag-C-jun和FlagC-junmut的细胞株.由图6可以看出，转染了质粒pFlag-c-jun的细胞中，1号细胞株能够稳定表达FlagC-jun.由图7可以看出，转染了pFlag-c-junmut的细胞中，2号细胞株能够稳定表达Flag-C-junmut.随后对2个筛选出来的细胞株进行免疫荧光染色，结果如图8所示.由图8可以看出，细胞中有Flag-C-jun和FlagC-junmut的稳定表达，且均在细胞核内.

图5 pFlag-c-jun和pFlag-c-junmut质粒转染后Western blot结果

图6 Flag-C-jun稳定表达细胞株的构建

图7 Flag-C-junmut稳定表达细胞株的构建

图8 Flag-C-jun和Flag-C-junmut稳定表达细胞株的免疫荧光染色

3、讨论

C-jun是一种转录因子，同时也是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的下游关键成员之一.C-jun参与调节多种细胞功能，包括细胞增殖、存活、分化、对紫外线辐射的反应、免疫反应和炎症等.C-jun可以帮助乙酰转移酶募集到RUNX2启动子，进而完成对组蛋白3特定位点的乙酰化促进RUNX2的转录[17];NMB(Neuromedin B）促进C-jun磷酸化，能够诱导COX-2和IL-6的表达上调[18];C-jun是激活AXL的必不可少的转录因子，促进与耐药相关的STC2-JUN-AXL-ERK通路[19];C-jun还参与p53的负调控，通过抑制p53的表达降低p21的积累，使得细胞周期能够顺利进行[20].

由于C-jun在多个生理过程中都发挥着重要作用，因此作为一个转录因子，其转录底物的研究非常重要.本研究通过点突变的方法，将C-jun序列中的DNA结合功能域切除，使C-jun无法形成二聚体与DNA结合.在此基础上，分别构建了能够稳定表达Flag-C-jun和Flag-C-junmut的细胞株.这些细胞株的构建有助于进一步通过ChIP实验研究转录因子C-jun的下游关键靶基因，为更加清晰深入地认识C-jun的生物学功能提供实验基础.

余斯琦,朱长军.癌基因C-jun及其缺失突变体过表达细胞株的构建与鉴定[J].天津师范大学学报(自然科学版),2020,40(02):39-43.

基金:天津市高校“十三五学科领军人才培养计划”资助项目(135205LJ24);天津市科技支撑计划重点资助项目(18YFZCSY00100);新疆维吾尔自治区科技支疆资助项目(2017E0263);天津师范大学应用开发研究基金资助项目(135202XK1708)