分泌型蛋白S100A6是S100家族的成员。它通过与靶细胞表面的糖基化终末受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)和Toll样受体结合产生旁/自分泌作用，参与增殖、凋亡、骨架重塑等多种细胞应答过程。文献报道，S100A6在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤的分期和淋巴转移相关，显著影响着肿瘤的预后[1]。但是，其作用机制尚未完全阐明。我们前期的研究发现，S100A6能够通过巨噬细胞间接地促进肿瘤增殖和迁移[2,3]。已知，肿瘤微环境中活化的巨噬细胞具有促进血管形成的作用[4,5]。基于此，我们推测S100A6可能经由巨噬细胞而间接地促进血管形成。

新生血管形成是肿瘤进展的一个重要环节，也是肿瘤治疗的一个重要靶点，因此探究肿瘤血管形成的机制可为肿瘤治疗提供新的线索。

浸润在肿瘤微环境(TME)中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)，是TME中最主要的免疫细胞，可达到肿瘤质量的50%[6]。它主要来自循环单核细胞，并且TAMs主要为M2型巨噬细胞。TAMs的高度浸润几乎与所有肿瘤的不良预后相关，因此TAMs已成为多种肿瘤治疗的靶标，期望通过调控TAMs活性以及减少其浸润从而抑制肿瘤的生长和转移[7,8]。已有研究发现，在胰腺癌模型中，干预CCL2/CCR2信号转导通路能够显著减少巨噬细胞浸润，有效抑制肿瘤的生长和转移[9];同时，抑制巨噬细胞活化的治疗策略也取得了一定的效果[10,11]。但由于TME成分复杂，招募和活化巨噬细胞的机制仍未阐明。

基于上述，我们推测微环境中S100A6参与巨噬细胞功能的诱导调控，通过招募和活化巨噬细胞间接促进新生血管形成。本研究以巨噬细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为研究对象，验证该假设，并探讨S100A6对巨噬细胞和血管形成的作用及其分子机制，希望为靶向血管形成和巨噬细胞招募及活化过程的肿瘤治疗提供新的证据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

人单核巨噬细胞系THP-1由本实验室(重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室)保存，HUVEC由重庆医科大学基础医学实验室馈赠。

1.1.2质粒及细菌

重组质粒pGST-moluc-hS100A6和pGST-moluc由芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室馈赠。感受态E.coli BL21为本实验室保存。

1.1.3 Transwell小室

购自洁特公司，孔径8μm。

1.1.4血管形成基质胶

购自康宁公司(美国)，货号356231.

1.1.5主要试剂

RPMI 1640培养基购自Hyclone公司;胎牛血清购自Gibco公司;蛋白质提取试剂购自碧云天生物技术研究所(上海);佛波酯购自Sigma公司(美国);TRIzol试剂购自Ta KaRa公司(日本);兔抗人t-JAK2、兔抗人p-JAK2、兔抗人t-STAT3、兔抗人pSTAT3购自戴格生物有限公司(杭州);兔抗人CD163、兔抗人IL-6、兔抗人CCL2、兔抗人VEGFA购自博奥森公司(北京);山羊抗兔Ig G、山羊抗鼠Ig G(北京)、荧光标记山羊抗兔Ig G(H+L)购自中杉金桥生物技术有限公司(北京);鼠抗人CD68购自Santa Cruz Biotechnology(美国);实验所用CD163、CCL2、IL-6、VEGFA、GAPDH引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;ECL试剂盒购自Pierce公司(美国);XL019购自碧云天生物技术研究所(上海);其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1细胞培养

THP-1细胞置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)培养，悬浮聚团生长，2～3天后直接传代。HUVEC细胞置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)培养，贴壁生长，2～3天后胰酶消化后传代。

1.2.2 GST-hS100A6和GST的制备及鉴定

方法同文献[12]。本实验中如无特殊说明，这两种重组蛋白的终浓度均为30μg/ml。

1.2.3细胞免疫荧光染色

以1×104个细胞/孔铺于24孔板内，PMA诱导24h后贴壁生长。更换新鲜无血清培养基，加入GST-hS100A6处理24h。PBS洗三遍，4%多聚甲醛固定30min,PBS洗三遍，3%BSA封闭1h。PBS洗三遍，CD68一抗(1∶100)4℃孵育过夜。PBS洗三遍，荧光标记二抗37℃孵育1h。PBS洗三遍。DAPI染核20min。PBS洗三遍，加入封片剂封片。荧光显微镜观察结果。

1.2.4血管形成试验

铺血管形成基质胶于96孔培养板，每孔50μl。分别以不加处理、GST和GST-h S100A6处理巨噬细胞，24h后收集条件培养基，分别命名为Blank-Mφ-CM、GST-Mφ-CM、A6-Mφ-CM。使用条件培养基重悬HUVEC，每孔1.5×104个细胞均匀铺于基质胶上。3h开始观察拍照。Image J软件分析结果。

1.2.5 RNA提取和实时荧光定量

TRIzol法提取细胞总RNA，取1μg逆转为c DNA。以GAPDH为内参照基因，实时荧光定量法检测各组CD163、CCL2、IL-6、VEGFA的mRNA水平。CD163的上游引物为5'-CCAGTCCCAAACACTGTCCT-3'，下游引物为5'-TTCTGGAATGGTAGGCCTTG-3';CCL2的上游引物为5'-CAGCCAGATGCAATCAATGCC-3'，下游引物为5'-TGGAATCCTGAACCCACTTCT-3';IL-6的上游引物为5'-TCACCTGGTCTTTTGGAGTTTGA-3'，下游引物为5'-AGAGCCCTCAGGCTGGACT-3';VEGFA的上游引物为5'-GGGCAGAA TCA TCACGAAGT-3'，下游引物为5'-TGGTGA TGTTGGACTCCTCA-3';GAPDH的上游引物为5'-CAGCGACACCCACTCCTC-3'，下游引物为5'-TGAGGTCCACCACCCTGT-3'。BioRad软件对目的基因表达水平进行分析。

1.2.6 Western blot

使用RIPA细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)裂解细胞，提取细胞总蛋白质。分光光度法测定蛋白质浓度。加入5×蛋白质样品缓冲液(样品:缓冲液=4∶1)并混合，煮沸10min使蛋白质变性。采用10%SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，之后转印至PVDF膜，5%BSA封闭2h。膜与特定的一抗在4℃孵育过夜(所有一抗均1∶1 000稀释)。TBST洗膜3次，每次10min。加入相应的二抗(1∶5 000稀释)后在37℃孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min。采用ECL发光液显色，凝胶成像系统采集图片，Image Lab 5.1软件分析结果。

1.2.7巨噬细胞迁移实验

接种对数生长期的THP-1细胞于Transwell小室上室中(105个细胞/孔)，使用100ng/ml PMA诱导贴壁24h后更换新鲜无血清培养基。下室分别加入GST、GST-hS100A6，先加XL019预处理1h后再加GST-hS100A6,24h后使用4%多聚甲醛固定小室膜，结晶紫染色后计数穿膜的细胞数。

1.2.8统计学方法

采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 6对各实验结果进行统计学分析。所有实验均独立重复三次，结果数据表示，组内两两比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PMA成功诱导人单核巨噬细胞系THP-1为巨噬细胞

参见图1。PMA诱导24h后，光学显微镜下悬浮成团生长的THP-1细胞(图1a)转变为贴壁生长，小圆形，有伪足伸出的巨噬细胞(图1b);同时，巨噬细胞标志物CD68的细胞免疫荧光染色检测呈阳性，进一步证实诱导成功(图1c)。

图1 THP-1经PMA诱导为巨噬细胞

2.2 S100A6诱导巨噬细胞向促血管表型(pro-angiogenic phenotype)转化，促进新生血管形成

(1)体外血管形成试验结果见图2。GST-hS100A6直接处理的HUVEC组，血管分支数和分支的长度与Blank组和GST组没有明显的差异，提示S100A6对血管的形成没有直接作用。A6-Mφ-CM组血管分支数及分支长度明显高于GST-Mφ-CM组(P值均小于0.05)。提示S100A6可通过活化巨噬细胞间接促进血管形成。

(2)通过Q-PCR和Western blot检测GST-hS100A6处理后巨噬细胞活化标志物的mRNA和蛋白质水平，包括M2型标志物CD163以及促血管形成因子CCL2、IL-6、VEGFA，结果见图3。GST-hS100A6组巨噬细胞中CD163、CCL2、IL-6、VEGFA的mRNA水平及其蛋白质水平均显著高于GST组(P值均小于0.05)。该结果一致提示S100A6可诱导巨噬细胞向M2型和促血管表型转化。

综上，S100A6能够通过诱导巨噬细胞向促血管表型转化，间接促进新生血管形成。

2.3 S100A6有招募巨噬细胞的作用，其机制涉及JAK2/STAT3信号通路的活化

(1)Transwell迁移试验的结果参见图4a、b,Blank、GST和GST-hS100A6组穿过小室的细胞数分别为41.0±6.5、48.0±3.6和67.7±3.2,GST-hS100A6组迁移的巨噬细胞数是GST组的1.4倍(P<0.01)。提示S100A6具有招募巨噬细胞的作用。

(2)S100A6可以通过结合靶细胞表面的RAGE，激活下游信号通路。通过Western blot检测RAGE下游信号通路的关键信号分子JAK2、STAT3的蛋白质及其磷酸化蛋白质水平，发现GST-hS100A6组的JAK2、STAT3蛋白质水平及它们的磷酸化蛋白质水平均高于GST组(P值均小于0.05;图4c、d)，提示S100A6可激活巨噬细胞的JAK2/STAT3信号通路。

图2 S100A6通过巨噬细胞间接促进血管形成

(3)XL019是高选择性的JAK2抑制剂。分别使用不同浓度的XL019处理巨噬细胞后，JAK2及STAT3的磷酸化被明显抑制，并呈现浓度依赖性(图5c)。Blank、GST、GST-hS100A6和XL019+GST-hS100A6组穿过小室的细胞数分别为38.0±6.2、46.3±6.1、74.3±4.5和51.0±6.2,XL019与GST-hS100A6联合处理组穿过小室的巨噬细胞数只有GST-hS100A6组的68.6%(P<0.01)，即JAK2抑制剂能部分抑制S100A6对巨噬细胞迁移的促进作用(图5a、b)。Western blot检测发现，XL019能够抑制GST-hS100A6对JAK2、STAT3及它们磷酸化水平的上调(图5d)，即Transwell迁移试验与Western blot检测结果一致提示S100A6具有招募巨噬细胞的作用，其机制涉及JAK2/STAT3信号通路的激活。

3、讨论

我们的研究发现，S100A6招募巨噬细胞，并诱导其转化为促血管表型，继而促进血管形成。

新生血管形成是肿瘤进展的一个重要促进因素，异常的血管网络可导致肿瘤局部的缺氧从而促进肿瘤的生长，并且混乱不成熟的血管网络也会降低治疗药物在肿瘤部位的扩散效率，从而影响药物治疗的效果。目前的研究认为，肿瘤血管形成与肿瘤相关上皮细胞、内皮细胞和基质细胞释放的多种调节因子有关，包括CCL2、IL-6、VEGFA、ANG、VEGFB、CXCL1、CXCL5、CXCL8、EGF、IL-1β等[5]。文献报道，VEGF信号转导能够刺激异常的血管生成并促进血管生长，在促血管生成过程中具有重要的作用，并且针对VEGF的治疗已经在临床肿瘤治疗中显现出一定的疗效[13]。提示靶向肿瘤血管形成过程的治疗方法将是肿瘤治疗的潜在策略。我们的研究发现微环境中S100A6对血管形成没有明显的直接作用，但是能够上调巨噬细胞中CCL2、IL-6和VEGFA的表达，即诱导巨噬细胞向促血管表型转化，继而促进血管形成。同时从实验结果也可以看出，巨噬细胞本身对血管形成具有一定的促进作用，而经S100A6处理的巨噬细胞，其促血管生成作用明显增强。

图3 S100A6促进巨噬细胞向促血管表型转化

巨噬细胞具有多种功能，参与组织发育和修复、病原体清除、慢性炎症、纤维化以及肿瘤发生、发展等多种过程。大多数研究认为，肿瘤微环境中的巨噬细胞为M2型，表达CD163、CD206、IL-10等标志物，通过调控肿瘤增殖、转移、新生血管生成等过程，显著影响肿瘤的进展、临床治疗和转归[14]。TAMs的高度浸润几乎与所有肿瘤的不良预后相关，基于此，TAMs已经成为多种肿瘤治疗的靶标，期望通过调控TAMs活性以及减少其浸润抑制肿瘤的生长和转移[15]。

我们的研究还发现，除了直接活化巨噬细胞外，S100A6还通过激活JAK2/STAT3信号通路招募巨噬细胞。S100A6作为RAGE的配体，可与靶细胞胞膜外的RAGE结合，激活下游PI3K/AKT、β-catenin、MAPK、JAK/STAT等信号通路[16,17,18]。JAK2/STAT3是RAGE下游的一条信号转导通路，其激活参与多种肿瘤的发生、发展，如JAK2/STAT3信号通路的激活参与卵巢癌和乳腺癌的转移过程[19]。也有文献报道，在神经纤维瘤中抑制STAT3显著减少巨噬细胞的浸润，从而抑制肿瘤的生长[20]。同时，也有研究认为JAK2/STAT3的激活与巨噬细胞向M2型极化相关[21]。由此提示，JAK2/STAT3信号通路还可能参与S100A6诱导巨噬细胞向M2型和促血管表型转化的过程，这将是我们接下来的研究方向。

综上所述，我们的结果证实了微环境中的S100A6能够通过激活JAK2/STAT3信号通路招募巨噬细胞，并进一步活化巨噬细胞向M2和促血管表型转化，上调M2型标志物CD163和促血管生成因子CCL2、IL-6、VEGFA的表达，从而间接促进新生血管形成。我们的研究结果为研究肿瘤血管形成提供了新的思路，也为靶向巨噬细胞招募和活化过程的肿瘤治疗提供了新的线索。

图4 S100A6促进巨噬细胞迁移并激活其JAK2/STAT3信号通路

图5 S100A6通过激活JAK2/STAT3信号通路招募巨噬细胞

参考文献：

[2]赵佳丽,谢佳卿,谷月,等.微环境中直接和间接促进结直肠癌细胞迁移.肿瘤,2018,38(6):553-561.

[3]陈露,黄茂,彭棋,等.通过巨噬细胞促结直肠癌细胞增殖的作用及机制.中国生物工程杂志,2019,39(4):1-7.

[18]李爱芳,谷月,李雪茹,等.促宫颈癌细胞增殖､迁移及其可能机制研究.中国生物工程杂志,2017,37(2):8-14.

林璐,户丽君,黄逸云,陈露,黄茂,彭棋,胡琴,周兰.S100A6通过招募和活化巨噬细胞促进血管形成[J].中国生物工程杂志,2020,40(05):7-14.

基金:重庆市渝中区科技计划(基础与前沿研究)(20160106)资助项目