肾上腺皮质癌(adrenal cortical carcinoma, ACC)是一种侵袭性强，患及各年龄段的恶性肿瘤，多数患者临床表现为肾上腺类固醇激素分泌过多，常规诊断为激素水平和影像学检查，存在一定误差和局限性，早期诊断困难，多数确诊患者处于Ⅲ、Ⅳ期，此时的肿瘤组织侵袭性强，多累及临近组织及器官，下腔静脉和肾静脉常有肿瘤栓子[1],5年疾病特异性生存率低至13%。有研究发现循环miRNA有良好的诊断能力，如miR-483-5p, miR-210[2],因其特异性和敏感性不足尚未用于临床[3]。目前ACC的治疗手段有限，多数免疫抑制剂并未起到很好疗效，积极探索ACC诊断、预后评价的生物标志物、免疫治疗点对患者生存率至关重要。

细胞凋亡及死亡的相关途径是肿瘤发生、发展的关键因素[4],细胞焦亡是一种细胞炎性凋亡，影响多种肿瘤的免疫微环境，从而影响肿瘤进展，焦亡是一种炎性小体依赖性的程序性细胞死亡，正常状态下，保护机体免受病原体感染，但随着反应加剧，可发生过度免疫反应，导致大规模的细胞死亡和正常组织损伤，引起机体过度炎症[5],从而影响肿瘤进展[6,7]。ACC的焦亡基因在免疫微环境中发挥的作用及其作为生物标志物的可行性尚无报道，探究焦亡基因对肾上腺皮质癌进程及预后的影响，具有前瞻性。

本研究采用生物信息学方法，筛选出焦亡相关基因来构建临床预后模型，并对其进行风险评估和相关临床特征的探究，相较于已有研究提供了更多元的理论角度。我们希望基于本研究的分析结果能为评估ACC患者的预后提供新思路，从而及时进行临床干预，改善预后。

1、资料与方法

1.1 获取肾上腺皮质癌相关数据

通过癌症基因组图谱(TCGA)公开数据库和Genotype-Tissue Expression(GTEx)数据库获取77名肾上腺皮质癌患者和128名正常人的基因表达数据和相关临床信息，并转化为TPM格式以便进行后续分析。在GEO数据库中下载GSE33371和GSE10927两个数据集的相关数据，并将其作为外部验证队列以确保风险模型的稳定性。

1.2 细胞焦亡相关差异表达基因(DEGs)预测及验证

在线网站GEPIA2分析肾上腺皮质癌与正常组织的差异表达基因，将|log2-fold change (FC)|阈值设定为1,q-value的阈值设为0.01,进入GeneCards数据库搜索细胞焦亡，获取相关基因后与差异表达基因取交集，获得肾上腺皮质癌中焦亡相关的DEGs。

对预测出的DEGs实时荧光定量法验证，收集2022年1月至2023年6月济宁医学院附属医院手术切除的3例ACC部分组织及其部分癌旁组织置-80 ℃冰箱保存。本研究济宁医学院伦理委员会审批通过(No.JNMC-2023-YX-039),且患者签署知情同意书。每配对组中切取20 mg癌组织及20 mg癌旁组织，天根科技生化有限公司的总RNA提取试剂盒提取RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，反转录试剂盒反转录成cDNA。SYBR Green试剂进行qPCR,其参数为：95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 循环数为40。以GAPDH作为内参照基因，通过2-ΔΔCt 方法计算目的基因的相对表达量。qPCR引物序列见 表1。

表1 qPCR的引物序列

1.3 肾上腺皮质癌预后模型的构建及验证

运用R包的glmnet包(4.1-2版本)和survival包(3.2-10版本)对焦亡相关的DEGs进行Lasso分析，采取十折交叉验证的方法再对筛选得到的基因进行单因素Cox回归分析，最终得到和患者生存相关的焦亡基因。根据上述基因进行肾上腺皮质癌预后风险模型的建立。计算风险因子时运用公式：Risk Score=Expression mRNA1×Coefficient mRNA1+Expression mRNA2×Coefficient mRNA2+...+Expression mRNAn×Coefficient mRNAn。survminer包和Log-rank检验对肾上腺皮质癌患者的临床总体生存进行Kaplan-Meier分析，P<0.05认为具有显著统计学差异。预后风险模型进行时间依赖性ROC分析，评估其预测临床风险的价值。曲线下面积(AUC)0.5～1.0之间说明该模型对肾上腺皮质癌患者的预后评价良好。在rms包(6.2-0版本)和survival包(3.2-10版本)中对预后模型进行单因素和多因素Cox回归分析，绘制对应的列线图(Nomogram)和Calibration校正图。对GSE33371和GSE10927两个验证队列进行外部验证，以确认风险模型的准确性。

免疫组化实验验证构建出的ACC预后模型，收集2018年1月到2023年7月济宁医学院附属医院病理科ACC患者的石蜡切块及其预后信息，检测CEP55、CTSV、IL32、MELK、GSDMD、APOE、KLF3-AS1的表达情况。

石蜡块切片，厚度5 μm, 40 ℃水温捞片，60 ℃烤片30 min, 将切片放入二甲苯I、II、III中各10 min, 100%、95%、80%、70%梯度酒精各浸泡10 min后水洗，滴加内源性过氧化物酶阻断液，室温孵育10 min, PBS水洗3次，每次5 min。EDTA微波热修复5～8 min, 自然冷却至室温。免疫组化笔组织画圈，滴加5%封闭血清，37 ℃孵育30 min, 向圈内组织滴加稀释好的一抗(abcam公司的兔抗人的抗体)100 μL,4 ℃孵育过夜，PBS清洗3遍，每次5 min, 滴加稀释好的二抗(北京中杉金桥生物的羊抗兔)100 μL,室温孵育1 h, PBS清洗3次，每次5 min, DAB显色液，滴加后镜下观察，控制显色时间，蒸馏水终止显色。苏木素复染40 s后，蒸馏水水洗。将切片分别放入70%、80%、95%、100%的酒精中脱水，各浸泡3 min, 依次放入二甲苯I、II、III中浸泡2 min, 中性树胶封片，观察结果并拍照。免疫组化染色评分由两名病理学专业从业10年以上医师独立进行，0无表达；1+弱表达；2+适度表达；3+强表达。

1.4 风险模型与相关临床特征的关系

Kruskal-Wallis test分析风险模型与肾上腺皮质癌患者在临床分期、年龄、性别的临床相关性，P<0.05认为具有统计学意义。

1.5 差异表达基因的功能富集分析

应用clusterProfiler包(3.14.3版本)对DEGs进行GO-KEGG和GSEA富集分析。Gene Ontology(GO)分析包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)、分子功能(MF)三部分，P.adj<0.05的基因被纳入分析，运用ggplot2包可视化分析结果。进行GSEA分析时认为基因在False discovery rate (FDR)<0.25且P.adjust<0.05的通路上显著富集。

1.6 肿瘤免疫微环境分析

运用GSVA包和ssGSEA算法对DEGs在24种免疫细胞中的浸润情况进行Pearson相关性分析。Mann-Whitney U检验对预后模型的免疫细胞浸润情况进一步分析，P<0.05表示具有统计学意义。TISIDB(http: //cis.hku.hk/TISIDB/index.php)是一个提供肿瘤和免疫系统相互作用数据的门户网站，为研究焦亡相关基因与共刺激分子、趋化因子等免疫因子的相关性提供依据，为探究潜在治疗靶点，运用Wilcoxon rank sum test对热门免疫检查点分子进行差异表达分析。

2、结果

2.1 筛选差异基因

通过GEPIA2网站获取肾上腺皮质癌中3 155个差异表达基因(图1A),与389个细胞焦亡相关基因取交集，筛选出47个DEGs(图1B)。对47个基因Lasso分析，16个基因的回归系数不为0,再对16个基因进行单变量Cox回归分析得到7个风险基因(KLF3-AS1、MELK、CEP55、CTSV、GSDMD、IL32、APOE)与患者总体生存率(OS)相关(图1C),再次进行Lasso分析构建预后风险模型。

2.2 焦亡相关基因的差异表达情况预测及验证

对7个焦亡相关基因ACC中差异表达情况进行具体分析，其中CEP55、CTSV、IL32、MELK在癌症组织中表达上调，GSDMD、APOE、KLF3-AS1在癌症组织中表达下调(图2)。

实时荧光定量验证ACC中7个DEGs的表达，与癌旁组织比较，ACC中CEP55、CTSV、IL32、MELK在癌症组织中表达上调，GSDMD、APOE、KLF3-AS1在癌症组织中表达下调(图3,P<0.01)。

2.3 建立并评价预后风险模型

利用Lasso分析得到的7个基因构建ACC预后风险模型(图4), 计算风险评分。风险评分=KLF3-AS1× (0.814 708)+MELK×(0.756 54)+CEP55× (0.439 75)+CTSV×(0.380 56)+GSDMD×(0.297 06)+IL32× (0.079 89)+APOE×(0.037 182)。

免疫组化部分染色结果截取如图5,7个风险基因(KLF3-AS1、MELK、CEP55、CTSV、GSDMD、IL32、APOE)评分带入预后风险模型，计算每个案例的得分，结果显示模型预测得分高的患者，对照其实际临床生存时间短、预后差，预测一致。

图1 筛选差异基因   

图2 肾上腺皮质癌中7个焦亡相关基因的差异表达(***P<0.001)   

根据风险评分的中位数将患者分为高风险组和低风险组，进行总体生存率评估，结果大多数高风险得分的患者生存时间短，预后较差(图6A)。对风险模型进行时间依赖性ROC分析，第2、4、6年的曲线下面积(AUC)分别为0.900、0.890、0.903,表明该模型预测临床预后的准确性高(图6B)。

患者OS的KM曲线分析为P<0.001,HR=0.07(0.03～0.14),差异显著，高风险组的PFI显著低于低风险组(图7)。纳入临床分期、静脉侵袭、淋巴浸润、年龄、性别等因素，进行单因素和多因素Cox分析，单因素回归分析表明静脉侵袭、淋巴浸润、相关临床分期、风险评分可作为评价预后的风险因素，多因素回归分析表明T分期和风险评分可作为独立评估预后的因素(图8A、B)。为定量评价临床患者的总体生存率，构建风险评分的预后列线图模型，由列线图可知随着总评分的增加，患者第2、4、6年的总体生存率逐渐下降，校准图中第2、4、6年的生存预测值与理想值基本一致，显示出良好的一致性(图8C、D)。

2.4 风险模型与临床特征的关系

进一步探究风险模型与ACC临床特征的关系，结果表明风险模型与临床T、N、M分期显著相关，与年龄和性别无关。此外临床病理分期的Ⅰ期与Ⅳ期、Ⅱ期与Ⅳ期的风险性存在显著差异(图9)。风险模型不仅能有效预测患者OS,一定程度上还能预测癌症的进展与分期，对临床诊断与治疗提供一定的参考。

图4 利用7个基因构建肾上腺皮质癌预后风险模型   

图5 高风险得分组(A)和低风险得分组(B)7因子的免疫组化图   

图6 风险模型的生存分析及ROC分析   

图7 患者OS(A)和PFI(B)的KM曲线分析  

2.5 风险模型进行外部队列验证

评估构建预后模型在ACC患者中的普适性，利用GSE33371和GSE10927作为外部队列进行验证。采取相同的风险评分计算方法将其分为高风险组和低风险组，随着风险评分的升高，高风险组患者的生存时间逐渐下降，高、低风险组的患者在临床OS方面有显著差异(P=0.015),低风险组有更好的预后。时间依赖性ROC分析显示验证队列预测患者第2、4、6年的生存率 准确性较高，AUC分别为 0.760、0.736、0.668(图10)。

2.6 7个焦亡相关基因的功能富集分析

GO分析结果表明7种DEGs主要参与核分裂、细胞器裂变、染色体分离、体液免疫反应、白细胞迁移、炎症反应的调节、化学突触传递的调节等生物过程。CC与染色体区域、纺锤体、浓缩染色体、神经突触、质膜受体复合物等细胞成分作用较大，具有细胞因子、受体配体、DNA 结合转录激活因子，RNA 聚合酶 II、G蛋白偶联受体等分子功能。KEGG通路分析7种基因与细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、细胞周期、钙信号通路、IL-17信号通路等有关。

GSEA探究7 个DEGs富集的具体通路，选择FDR< 0.25,P.adjust<0.05显著富集的通路进行可视化。结果显示多数基因显著上调了E2F、G2M-checkpoint、MYC通路(图11)。这些信号通路与细胞周期的调控、血管内皮的生成、肿瘤相关免疫反应密切相关。上述分析阐述了7种基因发挥功能的具体亚细胞定位及信号通路，与免疫系统相关过程和分子也存在密切联系，或许是导致过度炎症，引起疾病恶化的原因，因此需进一步对肾上腺皮质癌免疫微环境进行分析。

2.7 免疫微环境分析

癌症的进展、耐药性和肿瘤微环境(TME)息息相关，TME一种由免疫细胞、癌细胞、细胞因子、细胞外基质、间充质干细胞和血管组成的动态且复杂的环境[8,9]。癌症基质细胞(CAF)在肿瘤微环境的启动和发展中非常关键，与癌症的发展并行[10,11]。对风险模型在24种免疫细胞中的浸润情况分析，NK cells、Tgd、TReg、Eosinophils、aDC、Tem、T helper cells 7种细胞没出现统计学差异，高风险组和低风险组的另外6种免疫相关细胞(cytotoxic cells、Th1 cells、 Th2 cells、Mastcells、Neutrophils、TFH)的浸润水平存在显著差异(P< 0.001)。高风险组中B细胞、T细胞、CD8 T细胞、DC细胞的浸润低于低风险组，而相关免疫抑制细胞的浸润要显著高于低风险组(图12)。多数MHC分子、趋化因子如CXCL1、CXCL2及其受体、CD28、CD80、CD86等共刺激分子表达下调，推测影响了T、B、DC等免疫细胞的浸润，进而影响预后(图13)。

图8 风险模型Cox回归分析及预后列线图的构建与评价   

图9 风险模型与临床特征的相关性(*P<0.05,**P<0.01)  

图10 风险模型的外部队列验证   

2.8 潜在治疗靶点的探究

目前治疗ACC患者是手术切除为主，常规疗法为化疗与米托坦联合治疗，ACC侵袭性强，复发风险高。多种免疫检查点蛋白存在于肿瘤外泌体中，抑制免疫反应，促进肿瘤的侵袭和转移[12],研发针对于 免疫检查点蛋白的靶向药物是治疗新思 路。我们探究了PD-L1、CTLA-4、TP53、 CTNNB1在风险模型中的表达情况，结果显示PD-L1和CTLA-4在高、低风险组中的表达 量不足。但TP53和CTNNB1的表达在高风险组中明显升高，且两组具有显著差异(图14),可以作为未来治疗ACC的潜在靶点。

3、讨论

肾上腺皮质癌是肾上腺最常见的恶性肿瘤，患者预后差，手术切除肿瘤仅限于临床Ⅰ、Ⅱ期的患者，且术后复发率高，目前针对ACC的化疗和放疗等治疗效果也有限[13,14],探索新的生物标志物和免疫治疗点，及时诊判患者预后，对患者提升生存率至关重要。

本研究利用7个焦亡风险基因(KLF3-AS1、CEP55、CELK、GSDMD、CTSV、IL32、APOE)构建了ACC预后模型，OS和PFI的K-M曲线显示高风险组的生存率更低(PFI用来评估带瘤晚期患者的生存水平较好),为验证模型的准确性应用时间依赖性ROC分析，AUC均大于0.5,说明该风险模型对临床患者第2、4、6年OS的预测准确度高。为了定量评估模型中患者的生存率，纳入各种临床因素及风险评分建立列线图模型，其中Weiss评分利于评估肿瘤性质，校正图结果一致性也良好。ACC患者的预后情况与临床分期密切相关[15],模型与T、N、M分期相关性高，且两组在病理学Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期存在显著差异，该模型或可指导临床对ACC患者的分期及预后的及时评估，从而提前实施干预措施以改善预后。

为进一步探究影响癌症进展的作用机制，对差异表达基因进行GO-KEGG和GSEA富集分析。GO分析说明差异表达基因主要富集在炎症反应、体液免疫反应、细胞周期等生物过程及相关细胞成分。GSEA富集上调的通路主要为E2F、G2M-checkpoint、MYC,参与癌症中细胞周期的调控和肿瘤的侵袭等过程。相关研究认为相关调控细胞周期的基因过表达与ACC的预后不良有关[16]。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)-RB-E2F通路是介导细胞周期的核心机制，其决定了遗传物质复制及分配的准确性，其异常激活常导致细胞增殖发生较多错误，例如多倍体或非整倍体的生成，可促进肿瘤侵袭性和耐药性的发生[17]。由CDK1介导的G2M调节是致癌的关键因素，既有研究表明G2M通路上调的肿瘤更具侵袭性，且免疫环境中的免疫细胞浸润率更高，更易发生远处转移[18]。OSHI M等人的研究表明该通路的上调与较差的疾病特异生存率和总体生存率显著相关[19]。MYC信号通路的异常上调会促进细胞的持续增殖，诱导基因损伤，从而引发癌变，还会导致肿瘤免疫微环境的失调，抑制相关免疫反应[20]。上述通路除了影响细胞周期，还对肿瘤血管形成、细胞外基质重塑等肿瘤转移过程至关重要[16],从而使肿瘤微环境缺氧、恶化[21]。

我们的结果显示了ACC低风险患者在肥大细胞中的免疫浸润要高于高风险患者，肥大细胞浸润主要与抗肿瘤活性有关[22],而且多数趋化因子和共刺激分子的表达受阻，推测高风险 患者的抗肿瘤免疫反应被抑制，从而导致预后较 差。

免疫细胞的募集是免疫疗效的重要因素[23],而免疫细胞的募集需要共刺激分子、MHC分子、趋化因子等多种细胞因子参与。根据预测结果ACC风险模型中的患者免疫浸润较差，且T、B细胞表面的重要标志分子CTLA-4、PD-L1、CD80、CD86表达不足，因此多数ACC患者难以受益于常规的免疫疗法。TP53和DNNB1蛋白的突变阻碍了自发性T细胞浸润和DC细胞呈递相关抗原[24],但模型显示其可作为潜在的免疫治疗靶点。

图11 7个焦亡相关基因的功能富集分析  

图12 免疫细胞浸润分析(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)   

图13 免疫分子在ACC中的表达   

图14 探索潜在的治疗靶点(**P<0.01,***P<0.001)  

现阶段临床应用的免疫检查点抑制剂(ICIs)为抗PD-L1、抗CTLA-4等单克隆抗体。但ICIs治疗ACC患者疗效的临床Ⅱ期试验结果并不令人满意[25],常导致耐药性和多种不 良事件。失败原因有以下几点：ACC中PD-L1和 CTLA-4的表达量和敏感性不高、功能性ACC患者内源性糖皮质激素分泌过多，促进免疫抑制环境的形成、TP53和CTNNB基因的突变抑制自发性T细胞浸润，使免疫治疗无效[26]。

综上，本研究基于TCGA公开数据库和GTEx数据库及实验验证，利用生物信息学方法，鉴定出7个焦亡相关基因，成功构建出肾上腺皮质癌预后模型。来自GEO数据库的GSE33371和GSE10927队列验证预后模型结果良好。高风险组患者具有更差的预后，而且肿瘤微环境处于免疫抑制状态，导致常规免疫疗法效果不佳。多数焦亡基因富集在细胞周期通路，导致细胞增殖异常，促进了癌症进展。TP53和DNNB1癌蛋白可作为潜在治疗靶点，以改善免疫治疗失效的现状，希望该风险模型能为肾上腺皮质癌的预后识别及靶向治疗提供新思路。

参考文献:

[9]赵喆,白桦,王志杰,等.肿瘤微环境与免疫治疗耐药的关系及应对[J].现代肿瘤医学,2020,28(22):3985-3989.

基金资助:济宁市第一人民医院2022年度第一批“启航”科研项目(面上项目)(编号:2022QHM-018);

文章来源:孔令启,李昆芳,丁一等.基于细胞焦亡基因构建肾上腺皮质癌预后模型及免疫微环境分析[J].现代肿瘤医学,2024,32(08):1496-1506.