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星点设计—效应面法优化疏肝降脂胶囊提取工艺

2025-01-13 91 上传者：管理员

摘要：目的星点设计—效应面法(CCD-RSM)优化疏肝降脂胶囊提取工艺。方法以乙醇量、乙醇浓度和提取时间3个因素为考察对象，采用CCD-RSM法寻找最佳乙醇提取工艺，Design-Expert.v8.0.6对回归方程展开分析。结果对于乙醇浓度68.66%、乙醇用量为10.51倍、提取2次、每次111.95 min, OD值0.698,获得了最佳值，考虑到提取过程的方便性，将醇提取最佳条件定为10倍量70%乙醇提取2次，每次2 h。结论 CCD-RSM优化的疏肝降脂胶囊最佳提取工艺条件稳定，考察指标在可控范围最大，实际操作中具有一定可行性，为后期制剂工艺及大量生产奠定了基础。

关键词：
丹参
提取工艺
星点设计—效应面法
疏肝降脂胶囊
赤芍
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疏肝降脂胶囊是源于兰州市第二人民医院的验方，由丹参、赤芍、陈皮等药材组成，具有疏肝健脾、补肝益肾之功效。该方长期在临床使用，用于过食肥甘厚味、肝失疏泄、脾失健运等所致的脂肪肝和高脂血症等[1-3]。选用星点设计—效应面法(CCD-RSM)用于优化和分析疏肝降脂胶囊提取工艺的自变量(乙醇浓度、乙醇用量、提取时间)测得浸膏中丹参酮ⅡA含量和干膏收率为因变量，通过对自变量的不同水平进行二项式拟合，利用RSM优选最佳提取工艺并进行预测分析，该提取工艺可操作性强，精确度高，为制剂的开发和大量生产奠定基础[4]。

1、仪器及试药

1.1仪器

Agilent 1260 HPLC(美国安捷伦);电子天平(梅特勒托利多);真空干燥器(重庆大足);旋转蒸发器(上海医械专机厂);超声提取器(上海必能信超);多功能提取器(重庆市大足县医用设备厂，BLG- 40);型无级计量胶囊充填机(浙江东华制药机械公司，NBJP208);泡罩包装机(浙江东华，DPT-140型)。

1.2试药

丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110766-200619);磷酸(色谱纯，天津科密欧，批号：20200707);甲醇(色谱纯，山东禹王，批号：20200619051);乙醇(色谱纯，深圳西陇，批号：20200302)。

2、方法与结果

2.1丹参酮ⅡA含量测定

2.1.1色谱条件：

菲罗门C18色谱柱(250×4.6 mm, 5μm);流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(75∶25);检测波长：270 nm;柱温：30℃;流速1.0 ml/min;进样量10μl。高效液相色谱图见图1～3。

2.1.2供试品溶液：

精密称定干膏粉0.5 g置锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml溶解，称重超声提取30 min,放冷再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，即得。

2.1.3对照品溶液：

取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加入甲醇配制成浓度为0.028 8 mg/ml的储备液，作为对照品溶液。

2.1.4阴性对照品溶液：

准确称取不含丹参的其他组方量药材样品，按供试品溶液制备方法进行制备，即得。

2.2提取工艺单因素试验

2.2.1提取次数：

10倍量50%乙醇分别提取1～3次，每次1.5 h,测丹参酮 ⅡA含量，试验结果提示，随着提取次数的增加，干膏中丹参酮 ⅡA含量逐渐增加，但是第2次提取物和第3次提取物的含量差别不大，考虑到能耗，提取次数确定为2次。

图1丹参酮ⅡA对照品高效液相色谱图

图2供试品高效液相色谱图

图3丹参阴性样品高效液相色谱图

2.2.2乙醇浓度：

40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇10倍量提取2次，每次1.5 h,测定干膏中丹参酮ⅡA含量。试验结果提示，随着乙醇浓度增大，丹参酮ⅡA含量处于波动状态，当70%乙醇时丹参酮ⅡA含量最高，最终确定60%～80%为乙醇浓度范围。

2.2.3乙醇量：

分别用5、8、10、12、14倍量70%乙醇提取2次，每次1.5 h,测干膏中丹参酮ⅡA含量。试验结果提示，当乙醇量为10倍时丹参酮ⅡA含量最大，最终确定8～12倍为乙醇用量范围。

2.2.4提取时间：

10倍量70%乙醇分别提取30、60、90、120、150 min,提取2次，测干膏中丹参酮ⅡA含量。试验结果提示，当提取120 min后，丹参酮ⅡA含量达到极值，故选择提取时间范围为60～120 min。

2.3提取工艺优选

2.3.1实验设计[5-7]:

结合单因素实验结果，选取乙醇浓度、乙醇量、提取时间、提取次数为考察因素，其中非连续变量为提取次数，回归处理较难，按照常规的提取试验结果以2次为佳；根据星点实验设计原理，每因素设5水平，用代码值0、+1、1、+1.682、-1.682表示，见表1～2。以干膏中丹参酮ⅡA含量及干膏收率为评价指标，以相关系数R和P值评价模型的可预测性。

表1因素水平

表2实验设计与结果

2.3.2模型拟合与方差分析

2.3.2.1干膏收率模型拟合与方差分析：

使用Design-Expert.v8.0.6软件进行分析，以Y1值为因变量，通过对各因素进行多元二项式回归拟合，得干膏收率拟合模型：Y1=17.70+0.51X1+1.96X2+0.16X3-4.42×10-3X1X2-2.94×10-4X1X3+1.47×10-3X2X33.15×10-3X12 0.08X226.96×10-4X32。

对干膏收率拟合方程进行方差分析，各因素对Y1值的影响次序为：提取时间>乙醇用量>乙醇体积分数，X3影响显著，交互项影响不显著，二次项X22和X23的影响显著，X12影响不显著。干膏收率为(16.73±1.575)%,累积变异系数为9.4%,拟合方程相关系数R=0.857 5,模型P=0.046 8,具有显著性差异，信噪比5.064>4,提示信号充足可信，可通过干膏收率模型对提取工艺进行分析和预测，结果见表3～5。

表3干膏收率回归模型的方差分析

表4干膏收率响应面二次模型的方差分析

表5干膏收率响应面二次模型的方差分析

2.3.2.2丹参酮ⅡA含量模型拟合与方差分析：

使用Design-Expert.v8.0.6软件进行分析，以Y2值为因变量，通过对各因素进行多元二项式回归拟合，得丹参酮ⅡA含量拟合模型：Y2=11.40+0.20X1+0.73X2+0.04X3+3.31×10-4X1X2-1.6×10-5X1X3+2.58×10-4X2X31.52×10-3X120.03X222.07×10-4X23。对丹参酮ⅡA含量拟合方程进行方差分析，各因素对Y2值的影响次序为：提取时间>乙醇用量>乙醇体积分数，X3影响显著，交互项影响均不显著，二次项X12、X22、X32的影响均显著。丹参酮ⅡA含量为(1.21±0.57)mg/g,累积变异系数为47.23%,拟合方程相关系数R=0.8575,模型P=0.048 2<0.05,具有显著性差异，此模型的信噪比比率=4.806>4,提示信号充足可信，可通过丹参酮ⅡA含量模型对提取工艺进行分析和预测，结果见表6～8。

表6丹参酮ⅡA含量回归模型方差分析

表7丹参酮ⅡA含量响应面二次模型的方差分析

表8丹参酮ⅡA含量响应面二次模型的方差分析

2.3.3工艺优选及预测：

Design-Expert.v8.0.6软件得出最优提取条件：10.51倍量68.66%乙醇提取2次，每次111.95 min, OD值为0.698,绘制三维效应曲面图和等高线，见图4～9,考虑实际操作，将其调整为10倍量70%乙醇提取2次，每次120 min。

2.3.4验证试验：

按最优工艺条件进行3批中试提取，干膏收率为19.12%,丹参酮ⅡA含量为1.95 mg/g,总评归一值为0.681,预测值为0.698,偏差率为2.43%<3%,说明本试验所建模型可靠，预测性良好。

3、讨论

药物提取工艺优选时，需考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化，比较成熟的方法是正交设计、析因设计和均匀设计，均匀设计和正交设计均匀分散、整齐可比，但精度不够、预测性差，分析因设计考察全面，但实验次数太多，鉴于以上方法的缺点，相对新的方法是CCD-RSM,适用于大部分的非线性模型的实验设计，具有实验次数少、精确度高、预测性强、结果客观等特点，能弥补以上方法的不足[7-10]。

图4各因素对干膏收率影响的效应面图

图5各因素对干膏收率影响的等高线图

图6各因素对丹参酮ⅡA含量影响的效应面图

图7各因素对丹参酮ⅡA含量影响的等高线图

图8各因素对总评归一值影响的效应面图

图9各因素对总评归一值影响的等高线图

丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛等功效，用于胸痹心痛、癥瘕积聚、月经不调、疮疡肿痛，丹参酮ⅡA主要在丹参根部周皮合成和积累，用于保护心脑血管系统、保肝、抗纤维化等作用，是脂溶性成分，故确定乙醇作为提取溶剂，并对其浓度进行了单因素考察[4,11-15]。

干膏收率既反映中间品的产量和物耗，也与最终产品质量管控密不可分，合理恰当的干膏收率是保证中间品和成品质量稳定、均一，使制剂生产流畅，产品质量稳定可靠的关键指标[6]。干膏收率最重要的目的是保证提取的足够完全，并使有效成分含量最大化，让药品质量得到控制，保证疗效，并在此基础上降低生产成本，实现良好的经济效益。药材的出膏率不仅与药材品质优劣相关，还与成型工艺关系重大，如要做固体制剂，干膏收率太大会难成型，影响外观、性状及溶化性、崩解等，更会影响制剂单位剂量，干膏收率太小则使浸膏中被测成分的含量下降，从而影响临床疗效，干膏率波动幅度太大，则不能稳定地控制生产工艺，影响大生产流水线，降低产品质量。

干膏收率和丹参酮ⅡA含量是衡量前期提取工艺的重要指标，研究出膏率，可降低药品成本、控制药品质量，研究丹参酮ⅡA含量可发挥最大疗效，通过干膏收率和丹参酮ⅡA含量将药材质量和提取工艺参数控制到最佳程度，最终产品质量才有保证[1]。CCD-RSM研究了常规变量的贡献率，对可变因素进行方差分析，并提供最理想的操作条件，将丹参酮ⅡA含量和干膏收率作为评价指标，引入OD对多个因素处理，相关结果表明，模型有良好预测性。

试验结果显示，在一定范围内，干膏收率随着乙醇浓度和乙醇用量增大呈一定非线性增加趋势，曲面表现较陡峭，说明因素间的交互作用影响较大、等高线较密集；丹参酮ⅡA随着乙醇体积分数和乙醇用量增大而略微增高，曲面表现较平缓，说明乙醇体积分数和乙醇用量的交互作用对丹参酮ⅡA含量影响较小，且等高线较稀疏。

疏肝降脂胶囊的提取工艺采用CCD-RSM进行优选，在单因素试验的基础上，结合星点实验设计，以丹参酮ⅡA含量和干膏收率的OD值作为评价指标，对乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间3个因素进行了5水平考察，通过二次多项式对试验中各因素和水平进行拟合得回归方程，经预测分析并优化，得最佳提取工艺条件为：10倍量70%乙醇提取2次，每次120 min。试验表明，模型代表性好、实用性强，为下一步的成型工艺研究奠定基础。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

参考文献:

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