淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭 叶 淫 羊 藿E. sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿E. pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿E. koreanum Nakai的干燥叶[1]。其中，朝鲜淫羊藿集中分布于我国东北长白山地区，是吉林省首批道地药材之一，其淫羊藿苷类成分含量较高，是北方药用淫羊藿的主要来源[2]。淫羊藿性温，味辛、甘，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效[1]。现代研究表明，淫羊藿含有黄酮、多糖、木脂素、生物碱、萜类等多种化学成分[3―5]，具有提高免疫功能、抗骨质疏松、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗抑郁等多种药理作用[6―7]。羊脂油炙法是炙淫羊藿最为常见的一种炮制方法，从南北朝时期一直沿用至今[8]。羊脂油性温，能增强淫羊藿补肾壮阳的作用[9]。2020年版《中国药典》记载“每100 kg淫羊藿，用羊脂油（炼油）20 kg”，但无炒制功率、炒制时间和入药温度（即入药前锅底温度）等炮制工艺参数，导致炙淫羊藿存在质量参差不齐、不合格率较高的问题[10]。基于此，本研究以朝鲜淫羊藿为研究对象，采用正交实验优化羊脂油炙朝鲜淫羊藿的炮制工艺参数，并比较朝鲜淫羊藿炮制前后特征图谱的差异，以期为朝鲜淫羊藿的炮制工艺和质量标准研究提供参考。

1、材料

1.1　主要仪器

1260型高效液相色谱仪购自美国Agilent公司；MS-105D型十万分之一电子分析天平购自瑞士MettlerToledo公司；QE-100型高速万能粉碎机购自浙江屹立工贸有限公司；H1650-W型台式高速微量冷冻型离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHG 9070A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2　主要药品与试剂

淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品（批号分别为110737-202017、111852-202104，纯度分别为98.1%、99.2%）均购自中国食品药品检定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C对照品（批号分别为J12HB184811、J12HB184812、N18GB166250，纯度均为98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱醇，水为超纯水。15批朝鲜淫羊藿药材收集于吉林省通化市通化县（编号S1～S5）、辽宁省抚顺市新宾县（编号S6～S10）、辽宁省丹东市凤城市（编号S11～S15）3个不同产区（实验前按2020年版《中国药典》淫羊藿“炮制”项下方法制备朝鲜淫羊藿丝[1]）。羊脂油购自吉林敖东药业集团股份有限公司。上述两类药材经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为小檗科植物朝鲜淫羊藿E. koreanumNakai的干燥叶和牛科动物绵羊Ovis aries L.的脂肪油。

2、方法与结果

2.1　淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ含量测定方法的建立

2.1.1　色谱条件

色谱柱为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min，24%A→26%A；30～31 min，26%A→45%A；31～45 min，45%A→47%A）；流速为1 mL/min；柱温为30℃；检测波长为270 nm；进样量为10μL。

2.1.2　混合对照品溶液的制备

分别精密称取淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，置于不同10 mL容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，制成淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ质量浓度均为500μg/mL的单一对照品储备液。精密吸取上述储备液各适量，置于同一容量瓶中，以甲醇稀释，制成淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ质量浓度分别为40.000 0、10.080 0μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3　供试品溶液的制备

取羊脂油炙朝鲜淫羊藿适量，打粉，过三号筛；精密称取该粉末0.2 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）1 h；放冷，再次称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀；滤过，取续滤液，以12 000 r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.1.4　含量测定

参考2020年版《中国药典》淫羊藿“含量测定”项下方法，精密吸取“2.1.2”和“2.1.3”项下混合对照品溶液和供试品溶液各10μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。

2.2　羊脂油炙朝鲜淫羊藿综合评分的计算

2.2.1　外观性状评分

参照2020年版《中国药典》“炙淫羊藿”项下的性状描述“本品形如淫羊藿丝，表面浅黄色显油亮光泽，微有羊脂油气”，本研究选择颜色和气味为指标进行外观性状评分，具体评分如表1所示。

表1　外观性状评分表

2.2.2　醇溶性浸出物测定

参照2020年版《中国药典》（四部）浸出物测定法（通则2201）中醇溶性浸出物测定法项下的冷浸法测定[11]，用稀乙醇作溶剂。

2.2.3　综合评分的计算

为全面反映羊脂油炙朝鲜淫羊藿的质量，本研究以外观性状（颜色+气味）、醇溶性浸出物含量及淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ总含量的综合评分作为评价指标，并根据各指标的重要程度赋予权重。朝鲜淫羊藿经炮制后，其淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ的含量增高，且这两种成分具有温肾助阳的药理作用[4]，故设淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ总含量的权重系数为50%；考虑到中药化学成分的复杂性，醇溶性浸出物含量可综合反映羊脂油炙朝鲜淫羊藿的内在成分含量，故设醇溶性浸出物含量的权重系数为20%；饮片的外观性状是评价炮制饮片质量优劣的传统评价指标，故设外观性状权重系数为30%。具体计算方法如下 ：综 合 评 分Y＝100× （[ Y1/Y1max）×30%+（Y2/Y2max）×20%+（Y3/Y3max）×50%]，其中，Y1～Y3分别为某批次羊脂油炙朝鲜淫羊藿的外观性状评分、醇溶性浸出物含量、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ总含量，Y1max～Y3max分别为上述指标的最大值。

2.3　羊脂油炙朝鲜淫羊藿的正交实验优化

2.3.1　正交实验设计根据前期单因素实验结果，采用L（9 34）正交表，以炒制功率（A）、炒制时间（B）、入药温度（C）3个因素为自变量，以综合评分为评价指标进行正交实验设计，因素水平表见表2。

表2　正交实验因素水平表

2.3.2　正交实验结果分析

取9份朝鲜淫羊藿，每份20 g，按照规定的炒制功率、炒制时间、入药温度进行炒制，取出，放凉，即得到1～9号羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品。以综合评分为评价指标，优化羊脂油炙朝鲜淫羊藿的炮制工艺。正交实验设计及分析结果见表3，方差结果见表4。

表3　正交实验设计及分析结果

表4　方差分析结果

从表3和表4可以看出，各因素对综合评分的影响大小依次为A＞C＞B，即炒制功率＞入药温度＞炒制时间。因此，确定羊脂油炙朝鲜淫羊藿的最佳炮制工艺为A2B1C3，即取4 g羊脂油以600 W功率加热熔化，待锅底温度达到140℃时加入朝鲜淫羊藿丝20 g，炒制6 min，取出，放凉。

2.3.3　验证实验

取同一批朝鲜淫羊藿饮片3份，每份20 g，按“2.3.2”项下最佳炮制工艺制备样品，并计算综合评分。结果显示，3批样品的综合评分均值为98.94分，RSD小于3%，表明该工艺稳定、重复性良好。

2.4　朝鲜淫羊藿炮制前后的特征图谱分析

2.4.1　色谱条件

采 用Kromasil C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，15%A；5～10 min，15%A→20%A；10～20min，20%A→28%A；20～35 min，28%A→32%A；35～45min，32%A→45%A；45～55 min，45%A→60%A；55～60min，60%A→15%A）；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；检测波长为270 nm；进样量为10μL。

2.4.2　混合对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ对照品各适量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，制成上述成分质量浓度分别为75.982 2、8.017 5、19.999 5、16.202 4、10.000 0μg/mL的混合对照品溶液。

2.4.3　供试品溶液的制备

分别取朝鲜淫羊藿、羊脂油炙朝鲜淫羊藿（将15批朝鲜淫羊藿饮片按最佳炮制工艺炮制而得，编号Z1～Z15）粉末0.2 g（过三号筛），精密称定，置于具塞锥形瓶中；精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，超声处理（功率400 W，频率50 kHz）20 min；放冷，再次称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀；以12 000 r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，即得鲜淫羊藿供试品溶液和羊脂油炙朝鲜淫羊藿供试品溶液。

2.4.4　精密度试验

取羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品（Z1）适量，按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样分析6次，以8号峰（淫羊藿苷）为参照峰S，计算得各特征峰相对保留时间的RSD均≤0.45%，相对峰面积的RSD均≤2.86%（n＝6），表明该方法精密度良好。

2.4.5　重复性试验

取羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品（Z1）适量，共6份，分别按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，以8号峰（淫羊藿苷）为参照峰S，计算得各特征峰相对保留时间的RSD均≤0.32%，相对峰面积的RSD均≤0.29%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.4.6　稳定性试验

取羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品（Z1）适量，按照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，于室温放置0、2、4、8、12、24h时按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，以8号峰（淫羊藿苷）为参照峰S，计算得各特征峰相对保留时间的RSD均≤0.47%，相对峰面积的RSD均≤2.92%（n＝6），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.4.7　特征图谱的建立

将15批朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品，分别按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。将15批朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的色谱图检测数据积分处理后，以AIA数据格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行处理，分别以S1、Z1为参照图谱，经多点校正后采用Mark峰匹配，时间窗宽度设为0.1 min，以平均数法生成对照指纹图谱R与朝鲜淫羊藿、羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的特征图谱（图1）。由图1可知，15批朝鲜淫羊藿样品共有16个共有峰，15批羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品共有15个共有峰；进一步与混合对照品溶液的色谱图（图2）比对，确定峰2为绿原酸、峰5为朝藿定A、峰6为朝藿定B、峰7为朝藿定C、峰8为淫羊藿苷、峰14为宝藿苷Ⅰ。与相应对照特征图谱R相比，15批朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的特征图谱相似度均大于0.9，说明同一饮片不同批次间的整体质量较为稳定。

图1 15批朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的特征图谱

图2　混合对照品溶液的高效液相色谱图

2.4.8　聚类分析

以15批朝鲜淫羊藿、羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的共有峰峰面积为变量，运用SPSS 26.0软件进行聚类分析，结果见图3。结果显示，当欧氏距离为20时，朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿各自聚为一类，提示朝鲜淫羊藿生品与炙品的化学成分一致性良好，也进一步验证了羊脂油炙朝鲜淫羊藿炮制工艺的稳定性。

图3 15批朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的聚类分析图

2.4.9　主成分分析

将15批朝鲜淫羊藿、羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件进行主成分分析，结果见图4。结果显示，前3个主成分的累计方差贡献率为86.21%，可反映朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品特征图谱的大部分信息。进一步分析发现，15批朝鲜淫羊藿样品和15批羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品各自聚为一类，与聚类分析结果一致。

图4 15批朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿样品的主成分分析图

2.4.10　正交偏最小二乘-判别分析

依据“2.4.9”主成分分析结果，建立监督模式的正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）模型，结果见图5。结果显示，该模型的解释能力参数R2Y为0.961，预测能力参数Q2为0.944，表明建立的数学模型稳定性好且预测能力较强。根据变量重要性投影（variable importanceprojection，VIP）值＞1的原则筛选差异成分[12]，发现峰13、峰15、峰9、峰1、峰8、峰12、峰7、峰10是区分朝鲜淫羊藿生品、炙品的主要贡献峰，其对应的化学成分可以考虑作为朝鲜淫羊藿炮制工艺的质量控制指标成分。

3、讨论

朝鲜淫羊藿为补肾壮阳常用药，因具有独特的化学成分和显著的生物活性一直是国内外研究的热点[13]，但在2020年版《中国药典》中，羊脂油炙朝鲜淫羊藿的具体炮制工艺参数尚不明确。研究发现，炮制过程中淫羊藿所含的多糖苷黄酮类成分（朝藿定A、朝藿定B等）向低糖苷黄酮类成分（淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ等）转化，更利于人体吸收以增强温肾助阳作用[14―15]。由于中药化学成分较多，仅凭几种化学成分难以评判中药的整体质量，而浸出物是一种能够反映中药整体质量及中药成分复杂多样性的重要质量控制指标。另外，中药材在炮制过程中的形态、色泽、气味等可能发生变化。因此，本研究以外观性状（颜色+气味）、醇溶性浸出物含量及淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ总含量的综合评分作为评价指标，以炒制功率、炒制时间、入药温度为考察因素，结合正交实验优化羊脂油炙朝鲜淫羊藿的最佳炮制工艺。结果显示，羊脂油炙朝鲜淫羊藿的最佳炮制工艺为：取4 g羊脂油以600 W功率加热熔化，待锅底温度达到140℃时加入朝鲜淫羊藿丝20 g，炒制6 min，取出，放凉。

中药化学成分复杂、作用靶点多，本研究建立了朝鲜淫羊藿和羊脂油炙朝鲜淫羊藿的特征图谱，以期评价朝鲜淫羊藿炮制前后的差异。结果显示，在朝鲜淫羊藿的特征图谱中共指认了16个共有峰，在羊脂油炙朝鲜淫羊藿的特征图谱中共指认了15个共有峰，相似度均大于0.9，说明样品整体质量稳定。由于相似度无法有效区分朝鲜淫羊藿与羊脂油炙朝鲜淫羊藿，因此本研究进一步采用聚类分析、主成分分析等化学计量学方法分析两者的差异。结果显示，朝鲜淫羊藿与羊脂油炙朝鲜淫羊藿可明显聚为两类，说明朝鲜淫羊藿的化学成分在炮制过程中产生了变化；根据VIP值分析发现，峰13、峰15、峰9、峰1、峰8、峰12、峰7、峰10的VIP值均大于1，说明其对应的化学成分可以作为朝鲜淫羊藿炮制工艺的质量控制指标成分。

综上所述，本研究成功优化了羊脂油炙朝鲜淫羊藿的炮制工艺参数，并发现朝鲜淫羊藿炮制前后的特征图谱具有明显差异，其中峰13、峰15、峰9、峰1、峰8、峰12、峰7、峰10所对应的化学成分可能是朝鲜淫羊藿炮制前后的差异成分。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M]. 2020年版.北京:中国医药科技出版社,2020:340-341.

[2]郭宝林,肖培根.中药淫羊藿主要种类评述[J].中国中药杂志,2003,28(4):303-307.

[3]曹菁,王淑敏,宋凤瑞,等.淫羊藿叶HPLC指纹图谱的建立及2个化学成分含量的测定[J].特产研究,2020,42(2):47-55.

[4]李莉,王嘉瑞,王晶,等.淫羊藿的主要化学成分､药理作用研究进展及质量标志物的预测分析[J].中华中医药学刊,2023,41(11):143-151.

[8]秦振娴.柔毛淫羊藿与心叶淫羊藿生长发育及其品质形成研究[D].北京:北京协和医学院,2020.

[9]徐凤娟,孙娥,张振海,等.中药炮制辅料羊脂油的研究思路探析[J].中华中医药杂志,2014,29(8):2543-2547.

[10]裴利宽.淫羊藿药材HPLC､IR指纹图谱法鉴别和质量研究[D].北京:中国协和医科大学,2006.

[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[M]. 2020年版.北京:中国医药科技出版社,2020:232-233.

[12]张云飞,张玖捌,陈鹏,等.基于性状电子检测技术结合机器学习的不同产地薏苡仁的快速鉴别[J].中草药,2024,55(12):4185-4193.

基金资助:国家中医药管理局中药炮制技术传承创新项目(No.GZY-KJS-2022-053);江苏省中医药科技发展计划项目(No.ZD202316);江苏省知识产权战略推进计划项目(No.GJ20231160_01);

文章来源:郝建威,张玖捌,毛春芹,等.羊脂油炙朝鲜淫羊藿的炮制工艺及特征图谱研究[J].中国药房,2025,36(05):546-551.