穿山甲Manis Squama为鲮鲤科穿山甲属动物穿山甲Mani spentadactyla Linnaeus的鳞甲，味咸，微寒，归肝、胃经，具活血消癥、通经下乳消肿排脓、搜风通络的功效[1,2,3]。临床可用于妇科疾病、前列腺疾病及儿科疾病等方面[4]。穿山甲通常为炮制后使用，《中国药典》2015年版收载的炮制品有炮山甲与醋山甲，传统炮制方法一般需在温度210～250℃下砂炒数分钟[5]，前期研究表明，穿山甲高温砂炒炮制过程会促进一系列环二肽的形成[6]，包括L-丝-L-酪氨酸环二肽、D-丝-L-酪氨酸环二肽及L-甘-L-酪氨酸环二肽，且其中L-丝-L-酪氨酸环二肽具有显著的延长凝血时间、促进乳腺上皮细胞增殖及镇痛活性[7,8,9]。

研究发现穿山甲炮制前后蛋白质类成分鉴定数量差异显著，高温砂炒后穿山甲中鉴定出的蛋白质数量显著减少[8]，表明高温炮制可能破坏了蛋白质结构并使得部分蛋白质发生非特异性降解而难以被检测出来。穿山甲的高温炮制一方面会降解蛋白质从而减少蛋白质的鉴定数量，另一方面，高温炮制会破坏蛋白质原有结构，使其部分氨基酸位点发生化学反应与化学变化，从而影响蛋白质或降解肽段的性质。

蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是生物机体对翻译后的蛋白质进行化学修饰，以改变蛋白质的理化性质，从而影响蛋白质在体内的生物活性[10]。而动物药类中药在加工炮制、体内消化过程中，部分氨基酸位点发生的化学变化，称之为“修饰”。为此，本课题组提出“动物药修饰组（modificationsinanimal-derivedTCMs）”的概念，即围绕动物药中蛋白质、肽类成分在炮制加工、提取熬制过程发生的化学修饰、修饰类别、修饰位点、修饰数量等开展定性与定量研究[11]。本实验以穿山甲为研究对象，基于“蛋白质组-修饰组”的研究思路与方法，对炮制前后蛋白质肽类成分组成，氨基酸修饰类型、修饰位点及修饰数量等开展系统地比较研究，以阐明穿山甲物质基础，为穿山甲及角质类动物药加工炮制机制研究提供科学依据，也为穿山甲替代资源的寻找与评价提供方法与应用基础。

1、材料

1.1仪器

戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统，美国Dionex公司；ThermoQ-ExactivePlusOrbitrap质谱仪，美国ThermoFisher公司；BP211D电子天平，德国Sartorius公司；CentriVap离心浓缩仪、Freezone4.5plus冷冻干燥机，美国Labconco公司。

1.2试剂

穿山甲样品为苏州卫生职业技术学院馆藏标本，经南京中医药大学药学院段金廒教授鉴定为鲮鲤科穿山甲属动物穿山甲ManispentadactylaLinnaeus的鳞甲。碳酸氢铵、二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、碘乙酰胺（IAA）、Tris碱，购自南京翼飞雪生物科技有限公司；胰蛋白酶（质谱测序级）够自美国Promega公司，乙腈、甲醇、甲酸等质谱用试剂均为质谱级，德国Merck公司。SeppackC18固相萃取小柱，美国Waters公司；BCA蛋白测定试剂盒、多肽测定试剂盒，美国Thermo公司。

2、方法与结果

2.1穿山甲炮制

取净穿山甲3个批次（MS-1～MS-3），大小分开，分别用砂炒至鼓起，洗净，干燥，得炮山甲（PMS-1～PMS-3)[1]。穿山甲与炮山甲粉碎过200目筛，保存。

2.2穿山甲样品的提取与制备

穿山甲主要含有角质类成分，提取方法参照前期研究[12]，稍作改动。提取流程如图1所示，取穿山甲样品（MS-1～MS-3）、炮山甲样品（PMS-1～PMS-3）各10mg，每个样品加入1mL提取液（含4%SDS,20mmol/LDTT的Tris缓冲液），在65℃水浴孵育过夜，10000r/min离心10min，取上清液为穿山甲提取液，沉淀部分重复上述提取步骤2次，将3次提取液合并，分别为穿山甲提取液（MSs-1～MSs-3）与炮山甲提取液（PMSs-1～PMSs-3），沉淀部分用PBS反复洗涤3次，分别为穿山甲渣（MSp-1～MSp-3）与炮山甲渣（PMSp-1～PMSp-3）。

图1穿山甲样品提取制备流程

测定穿山甲提取液样品（MSs-1～MSs-3、PMSs-1～PMSs-3）蛋白质量浓度，每个样品中取200μg蛋白质总量的提取液，分别加入3倍体积的丙酮，至于-20℃静置4h后，10000r/min离心10min，弃去上清，用丙酮洗涤1次，挥干丙酮。加入200μL裂解液（含8mol/L尿素的Tris缓冲液，pH8）充分溶解蛋白后，加入pH8的Tris缓冲液1400μL稀释，按质量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育过夜；穿山甲渣样品（MSp-1～MSp-3、PMSp-1～PMSp-3）用pH8的Tris缓冲液混悬，扣除提取液中蛋白质总量后，按质量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育过夜。穿山甲提取液酶解样品与穿山甲渣酶解样品脱盐，干燥，纯水复溶后测定多肽总量，取20μg多肽溶液，再次干燥后用初始流动相复溶至多肽质量浓度为1μg/μL，待进样。

2.3基于NanoLC-MS/MS的蛋白组分析

戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为ReprosilC18AQ(150mm×75μm,5μm),LC-MS/MS系统分析样品。将穿山甲样品进样，上样量为2μL，体积流量400nL/min，流动相A（乙腈-甲酸-水2∶0.2∶98），流动相B（乙腈-甲酸-水80∶0.2∶20），线性梯度洗脱：0～150min,2%～30%B。ThermoQ-ExactivePlusOrbitrap质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z300～2000，分离宽度为m/z3；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离（CID）二级串联质谱，每个样品重复进样1次。采用Xcalibur软件进行数据采集。获得的MS/MS图谱采用PEAKS8.5软件进行搜库鉴定分析，检索劳亚兽总目（Laurasiatheria）蛋白质库，检索参数设置为前体离子误差1.0×10-5；子离子误差m/z1；允许2个位点误切，假阳性率（FDR）≤1%；样品搜库选择胰蛋白酶酶切（Trypsin）方式；其他参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义（P<0.05）被认定为有效的鉴定结果。

从各穿山甲样品中鉴定得到的肽段与蛋白质数量如表1所示，MSs共鉴定到254个蛋白质和2648个肽段，MSp共鉴定到640个蛋白质和7618个肽段，PMSs共鉴定到226个蛋白质和2754个肽段，PMSp共鉴定到181个蛋白质和2368个肽段；MS样品共鉴定到705个蛋白质和8628个肽段，PMS样品共鉴定到257个蛋白质和3327个肽段；PMSs中鉴定的蛋白质与肽段数量与MSs比没有显著性差异（P>0.05），而PMSp中鉴定的蛋白质、肽段数量与PMSs比则显著减少（P<0.01);PMS中鉴定的蛋白质、肽段数量显著少于MS(P<0.01）。尽管炮制过程使穿山甲蛋白质与肽段的鉴定总数减少，但是对于穿山甲提取液中可溶性蛋白质与肽段的鉴定数量无显著改变。

表1各穿山甲样品中鉴定得到的肽段与蛋白质数量

MSs中鉴定的蛋白质主要为I型角蛋白（keratin,typeI）、II型角蛋白（keratin,typeII）、连接蛋白（junctionplakoglobin）、延长因子（elongationfactor）、桥粒蛋白（plakophilin）、桥粒黏附蛋白（desmoglein）、14-3-3蛋白（14-3-3protein）等；MSp中鉴定的蛋白质除了上述主要的结构蛋白外，还发现蛋白二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase），肽基脯氨酸顺反异构酶（peptidyl-prolylcis-transisomerase），谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶（protein-glutamineγ-glutamyltransferase）等与角蛋白结构形成相关的蛋白酶。

通过绘制韦恩图对MSs、MSp、PMSs及PMSp样品蛋白质与肽段进行比较分析，如图2所示，4个样品重叠部分共有112个蛋白质，其中以角蛋白（18个）、核糖体蛋白、翻译起始因子、14-3-3蛋白（3个）等结构蛋白或参与合成的蛋白质为主。在MSp中鉴定出的特异性蛋白数量最多（达427个），而在PMSp样品中差异蛋白质的数量显著减少（仅8个）；在肽段的韦恩图中可见相似比例的分布情形。韦恩图的结果提示，除去MSp中鉴定出的差异蛋白质与肽段外，大部分的蛋白质或肽段分布在重叠部分，之所以炮制后的PMSp样品蛋白质与肽段数量均显著减少，可能由于高温炮制的破坏导致部分蛋白质鉴定缺失。

2.4穿山甲样品脱酰胺与氧化修饰的对比分析

获得的MS/MS图谱采用PEAKS8.5软件进行修饰类型、修饰位点与修饰数量进行分析时，将PTMs的参数设置为可变翻译后修饰选择氧化修饰（oxidation,m/z+15.99）；脱酰胺（deamidation,m/z+0.98);PTMs的得分Ascore设置为≥20被认定为有效的修饰结果。

图2穿山甲中鉴定的蛋白质、肽段韦恩图

穿山甲在炮制过程中主要发生脱酰胺与氧化修饰，炮制前后脱酰胺与氧化修饰的比例显著变化（P<0.05），如表2所示，MS样品中Asn发生脱酰胺修饰的比例为18.52%,Gln发生脱酰胺修饰的比例为10.83%,Met发生氧化修饰的比例为37.56%；经过高温炮制后的PMS样品中各修饰比例分别变化为25.60%、12.60%与22.69%。穿山甲炮制后脱酰胺修饰比例上升，其中Asn发生脱酰胺修饰的比例显著升高（P<0.05),Gln发生脱酰胺修饰的比例升高，但未表现出显著性差异；炮制后氧化修饰的比例显著下降（P<0.05）。

表2穿山甲样品炮制前后脱酰胺与氧化修饰的比例

2.5穿山甲I型与II型角蛋白修饰比例与修饰位点的对比分析

角蛋白、连接蛋白、桥粒蛋白等结构蛋白为穿山甲的主要蛋白质类型，以I型、II型角蛋白为例，统计比较穿山甲炮制前后脱酰胺修饰数量、氧化修饰数量、肽段覆盖率（coverage）、鉴定肽段（identifiedpeptides）数量、唯一肽段（uniquepeptides）数量、肽谱匹配（peptidespectrummatches,PSM）数量的差异，其中修饰的数量以单位数量肽段（100个肽段）含有羟基化与脱酰胺修饰的PSM数量进行统计，结果见表3。

由表3可见，I型、II型角蛋白炮制后脱酰胺数量均显著高于炮制前（P<0.05、0.01），而氧化修饰未见显著性差异，表明在炮制过程中角蛋白发生了大量的脱酰胺修饰；表3炮山甲样品鉴定的角蛋白肽段数量均显著多于炮制前（P<0.01）。鉴定肽段数量、唯一肽段数量及肽段覆盖率越高，提取获得的蛋白质、肽段的信息越多，则鉴定结果越准确，因此，这些指标也间接反映了样品前处理时蛋白质、多肽提取的效率。在相同的提取条件下，炮制后的样品能鉴定到更多的蛋白质和肽段，提示炮制也许可促进角质类蛋白质的溶出。

表3I型、II型角蛋白炮制前后修饰的变化

以I型角蛋白炮制前后的变化为例说明脱酰胺位点、肽段数量、PSM及肽段序列的差异。如图3所示，紫色箭头表示炮制后的I型角蛋白较炮制前新出现的脱酰胺修饰位点，包括Gln75、Asn80、Asn101、Gln178、Gln203与Gln336。以胰蛋白酶酶切后形成的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR为例，在炮制前的样品中，仅测到GDLERQNQEYQVLLDVR与GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR2条肽段；而炮制后的样品中，测到了序列相同但是含有不同脱酰胺修饰的肽段共7个，除了炮制前检测到的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR与GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR外，还包括GDLERQN(+0.98)QEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)NQEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)N(+0.98)QEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR与GDLERQ(+0.98)NQEYQ(+0.98)VLLDVR，分别在Gln334、Asn335、Gln336及Gln339发生了不同组合的脱酰胺修饰。如图3-C所示，比较MS/MS图谱可以看出，根据b离子或y离子的偏差，可准确计算出脱酰胺修饰的位点，序列GDLERQNQEYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分别为571.29、699.34、813.39、941.44、1070.49；而序列GDLERQ(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分别为571.29、700.33、814.37、943.41、1072.46，两者（b6+-b5+）值分别为128.05与129.04，表明肽段的6位Gln发生了修饰，两者（b7+-b6+）值相同，表明7位Asn未发生修饰，（b8+-b7+）值分别为128.05与129.04，则表明8位Gln也发生了修饰，从而明确脱酰胺修饰的位点。图3结果表明炮制后角蛋白修饰数量显著增加，相同氨基酸序列上发生不同位点修饰使得肽段鉴定数量也明显增加。

图3炮制前后I型角蛋白脱酰胺修饰比较

2.6穿山甲肽段相对分子质量与亲疏水性分布的对比分析

对MS与PMS样品中鉴定的全部肽段的相对分子质量（molecularweight,MW）与亲疏水性（hydropathicity）分布进行比较分析，亲疏水性以grandaverageofhydropathicity(GRAVY）值表示，GRAVY为负值则表示该结构单元亲水，正值则表明疏水。结果如图4所示，MW分布方面，除了MSp的肽段数量在<800部分较高（19.5%）与>2000部分较低（7.3%）外，MSs、PMSs与PMSp肽段的MW分布基本一致，即<800部分占比为11.8%～14.8%,800～1000部分为16.8%～17.2%,1000～1500部分为38.6%～40.8%、1500～2000部分为15.4%～17.7%,>2000部分为13.2%～14.2%。穿山甲肽段的亲疏水性分布也基本一致，MSs与MSp中亲水性肽段比例分别为64.5%与62.7%，稍低于PMSs与PMSp的66.4%与66.3%。总的说来穿山甲炮制前后样品鉴定肽段的相对分子质量与亲疏水性分布无明显差别，表明炮制过程对蛋白质及肽段亲疏水性无影响。

图4穿山甲肽段的相对分子质量分布与GRAVY值分布

3、讨论

角蛋白作为外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中，是结缔组织极其重要的结构蛋白质，起着保护机体的作用[13,14]。穿山甲的蛋白质类物质基础主要由角蛋白、连接蛋白、桥粒蛋白等结构蛋白以及促进角质致密结构形成的异构酶类组成。角蛋白等结构蛋白稳定性好，水溶性差，因此穿山甲以结构蛋白为主的物质基础难以溶出释放发挥功效[15]。传统用法及中医临床使用时，通常穿山甲生品不入药，需炮制后方可入药。为此，本实验基于“蛋白质组-修饰组”结合的研究思路与方法，系统比较研究穿山甲炮制前后蛋白质、肽类成分的变化，深入阐释了炮制过程对氨基酸修饰的影响，以期从蛋白质类成分变化的角度阐释穿山甲炮制规律及可能机制[16]。

本实验以穿山甲炮制前后样品为研究对象，经过蛋白质提取、酶切、LC-MS/MS分析鉴定后，获得穿山甲与炮山甲全部酶解肽段序列及PTMs信息，对脱酰胺修饰进行了全面系统的分析与比较，研究穿山甲炮制过程中脱酰胺修饰的规律。前期研究报道炮制可促进穿山甲一系列活性环二肽的形成，本实验通过比较蛋白质炮制前后的组成与修饰的差异探讨炮制的规律与影响。

炮制对穿山甲的影响包括：（1）尽管炮制对穿山甲可溶性蛋白质无明显影响，但可显著降低药渣中难溶性蛋白质数量，这可能有利于穿山甲可溶蛋白的溶出；（2）炮制可显著提高穿山甲蛋白质、肽类成分的脱酰胺修饰数量，显著提高角蛋白类结构蛋白肽段的鉴定数量，提高角蛋白Asn与Gln的脱酰胺修饰数量。本研究从蛋白质修饰的角度探讨了炮制对穿山甲物质基础的影响，高温炮制使Asn与Gln转变成Asp与Glu,-NH2转变为-OH，提高穿山甲中以角蛋白为主的结构蛋白的肽段鉴定数量，结果提示，穿山甲的炮制可能通过增加蛋白质修饰的发生促进蛋白质、肽类成分的溶出与释放，然而修饰肽段相对含量、修饰发生的阶段与发生机制仍不明确，有待后续进一步深入研究。

炮制对穿山甲蛋白质类成分的变化也可能影响传统功效的发挥，通过本实验的系统研究，对揭示穿山甲功效物质基础提出了新的研究思路，也为穿山甲替代资源的寻找与评价研究提供新的方法，具有重要的理论和现实意义。

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基金：国家重点研发计划资助(2018YFC1706100);国家自然科学基金面上项目(81973450);江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师(2016年);江苏省“333工程”第三层次(2016年);中华中医药学会“青年人才托举工程”(QNRC2-C14);江苏省高等学校自然科学研究项目(19KJB360020)