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痤疮杆菌使用20种清热类中药提取物的抑制作用选择

2020-07-21 583 上传者：管理员

摘要：目的探讨20种清热类中药提取物体外对痤疮杆菌的抑菌效果。方法选择菊花等20种常见的清热类中药为研究对象,对痤疮杆菌进行体外抑菌实验和最小抑菌浓度(MIC)测定。结果 20种中药提取物中,知母、夏枯草、黄芩、半枝莲4种中药提取物表现出对痤疮杆菌有明显的抑制作用,其MIC分别为0.360 9 g/L、6.25 g/L、3.125 g/L、3.125 g/L,而栀子、赤芍、石膏等清热类中药提取物则对痤疮杆菌无抑菌活性。结论筛选出的中药提取物可用于临床上治疗痤疮提供选择。

关键词：
最小抑菌浓度
清热类中药
痤疮丙酸杆菌
皮肤疾病
青春期
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痤疮是一种常见的皮肤疾病，主要因痤疮丙酸杆菌在皮肤毛囊皮脂腺内感染造成的一种慢性炎症性皮肤病，好发于青春期[1]。目前，治疗方法主要有化学药物治疗与中药治疗，化学药物治疗主要有维A酸类、抗生素类如克林霉素、红霉素、氯霉素等局部外用药物治疗与四环素类、大环内酯类、抗雄激素类口服药物治疗。江丽等[2]的实验证实大黄、黄芩、甘草、牡丹皮、金银花等中药对痤疮丙酸杆菌有抑制作用，其中大黄和黄芩的抑菌作用最强。这些治疗措施具有一定治疗效果，但也存在疗效不稳定、耐药性等问题。本研究拟选择菊花等20种常见的清热类中药为研究对象，对痤疮杆菌进行体外抑菌实验和最小抑菌浓度（MIC）测定，观察20种清热类中药提取物体外对痤疮杆菌的抑菌效果，筛选出抑菌活性强的中药，为临床治疗痤疮提供新的药物选择。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1药材

菊花（产地浙江，批号170601）、金银花（产地河南，批号170601）、白花蛇舌草（产地江西，批号170501）、黄芩（产地山西，批号170701）、大青叶（产地安徽，批号170901）、板蓝根（产地陕西，批号170701）、决明子（产地广东，批号170501）、射干（产地广西，批号170401）、牡丹皮（产地安徽，批号170601）、黄连（产地四川，批号160802）、生地黄（产地河南，批号170701）、玄参（产地浙江，批号170301）、知母（产地河北，批号170601）、赤芍（产地内蒙古，批号170801）、芦根（产地江苏，批号170901）、夏枯草（产地湖北，批号170701）、鸡屎藤（产地广西，批号170501）、鱼腥草（产地湖南，批号170801）、半枝莲（产地湖北，批号170701）、蒲公英（产地湖北，批号170701）、鸡屎藤（产地广西，批号170501），上述药材购自广东一信药业有限公司。

1.1.2菌株与试剂

ATCC 6919痤疮丙酸杆菌（上海复祥生物科技有限公司，冻干管，批号20171030），硫乙醇酸盐流体培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号20171106)

1.1.3仪器

电子天平（常熟市双杰测试仪器厂，型号JJ224BC），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，型号RE-3000），冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司，型号LGJ-100F），数显电热干燥箱（浙江力辰仪器科技有限公司产，型号尚仪101-00A），涡旋混合器（常州朗越仪器制造有限公司，型号XH-C）。

1.2方法

1.2.1中药提取物的制备

分别取生药适量，粉碎成粗粉，准确称取100 g中药粉末于烧杯中，加1:8比例的纯化水800 ml，置于电热套上加热，沸腾后保持微沸，煎煮45 min后，200目滤布过滤，滤渣加800 ml水在电热套上加热，沸腾后保持微沸，煎煮45 min,200目滤布过滤，合并滤液，静置冷却至室温，在70℃下真空旋蒸浓缩至各滤液500～600 ml，置冷冻干燥机干燥成冻干粉，取出冻干粉研磨并装于无菌袋子后密封，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2中药提取物供试液的制备

在超净台无菌条件下，分别取中药提取粉末1 g，用5 ml无菌水于试管中溶解并稀释成200 g/L的中药提取物供试液，编号，并用涡旋混合器混合溶解备用。

1.2.3硫乙醇酸盐固体培养基的配制

准确称取硫乙醇酸盐流体培养基粉末2.90 g于耐高压玻璃瓶中，再加1.50 g琼脂，加蒸馏水100 ml，加热搅拌溶解至煮沸，高压灭菌锅121℃下灭菌20 min，在超净台无菌条件下倒平板，待其冷却凝固后倒置，用封口胶密封，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.4硫乙醇酸盐流体培养基的配制

准确称取硫乙醇酸盐流体培养基粉末（具体成分与含量见表1)5.80 g于耐高压玻璃瓶中，再加蒸馏水200 ml，加热搅拌溶解，分装至20支试管中，塞上试管塞，高压灭菌锅121℃下灭菌20 min，在超净台无菌条件下，用封口胶密封，待其冷却后置于4℃冰箱保存备用。

表1硫乙醇酸盐流体培养基生化试剂成分(g/L)(25℃，pH7.1±0.2)

1.3.5痤疮丙酸杆菌菌种活化

在超净台无菌条件下，取痤疮丙酸杆菌冻干管，用浸过75%乙醇的脱脂棉球轻轻擦干净安瓿管的外部，再用酒精灯火焰加热安瓿管的顶端，往加热过的安瓿管滴少量无菌水顶端使之破裂，用镊子小心敲下已破裂的安瓿管顶端，用移液枪吸取100～200μl无菌水，滴入安瓿管内轻轻震荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，用移液枪吸取菌液接种移植于硫乙醇酸盐固体培养基，再用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀，加盖，将涂抹好的平板放置于超净台20～30 min，使菌液逐渐渗透入固体培养基内，然后用封口胶密封，将平板倒置（琼脂平板的底部向上），放于厌氧袋中，于37℃培养箱中培养48 h。

1.3.6痤疮丙酸杆菌分离传代

采用三区画线法，在超净台无菌条件下，取已长出来的痤疮杆菌平板，接种环先在乙醇灯火焰下灭菌，待冷却后用接种环垂直挑取细菌的单个菌落，将沾菌接种环在硫乙醇酸盐固体培养基的第一区作数次画线，再在二区、三区依次用接种环画线，每一区域的画线应接触上一区域的接种线2～3次，使菌量逐渐减少，使其形成单个菌落。画线完毕，将平板加盖，倒置（琼脂平板的底部向上），放于厌氧袋中，于37℃培养箱中培养48 h。

1.3.7菌悬液的制备

在超净台无菌条件下，取已传代的痤疮丙酸杆菌平板，用移液枪在平板上轻轻刮下少许痤疮杆菌的菌落，用硫乙醇酸盐液体培养基在EP管中稀释调整为0.5个麦氏比浊单位（约为1.5×108 CFU/ml），取50μl菌液于另一EP管中，再加450μl硫乙醇酸盐液体培养基，混匀，吸取200μl菌液，用20 ml硫乙醇酸盐液体培养基在平板上校正浓度为1×104～105 CFU/ml，立即使用。

1.3.8 MIC测定

参考文献[3,4]的方法，在超净台无菌条件下，用移液枪分别吸取600μl中药提取物供试液于EP管中，再加600μl硫乙醇酸盐液体培养基稀释成100 g/L的药液，用移液枪吸取稀释的每种中药提取物溶液200μl到96孔板第1列孔中，用排枪吸取100μl硫乙醇酸盐液体培养基到96孔板第2、3、4列孔中，采用微量肉汤稀释法将药液稀释浓度为100 g/L、50 g/L、25 g/L、12.5 g/L，每孔药液为100μl，将稀释好的菌液用排枪吸取100μl至96孔板第1、2、3、4列孔中，第5列孔中加100μl硫乙醇酸盐液体培养基和100μl菌液作为阴性对照组，第6列孔加200μl硫乙醇酸盐液体培养基为空白对照组，封上封口膜，放于厌氧袋中，于37℃培养箱中培养48 h。肉眼观察培养液澄清者，表明其对应的中药提取物有一定抑菌作用，找出能完全抑制痤疮丙酸杆菌生长的最低药液浓度，即为MIC。若前4个孔的培养液澄清，则用倍半稀释法对药液进行进一步的稀释，继续用于后续实验，直至能确定MIC为止。以上实验平行操作3遍。

2、结果

在96孔板的无痤疮杆菌的空白对照孔中，培养液澄清，表明96孔板无杂菌污染，培养基稳定。在阴性对照孔中，培养液浑浊，表明痤疮杆菌能在硫乙醇酸盐液体培养基中很好地生长，对抑菌效果的测定没有影响。20种中药提取物中，知母、夏枯草、黄芩、半枝莲4种药材提取物表现出对痤疮杆菌有明显的抑制作用，而栀子、赤芍、石膏等清热类中药提取物则对痤疮杆菌无抑菌活性。见表2。

经过再次对浓度进行倍半稀释，知母、黄芩和半枝莲提取物仍对痤疮杆菌有抑制活性，夏枯草则无，实验筛选得到，知母、夏枯草、黄芩、半枝莲的MIC分别为0.360 9 g/L、6.25 g/L、3.125 g/L、3.125 g/L。见表3。

3、讨论

痤疮丙酸杆菌作为痤疮的主要致病菌，主要集聚于皮肤毛囊皮脂腺中。研究发现，痤疮患者的面部皮肤中检出痤疮杆菌的概率要明显高于正常人。痤疮丙酸杆菌与痤疮的发生过程的各个环节有密不可分的关系，而减少皮肤毛囊中的痤疮杆菌是治疗痤疮的最彻底的方法。因此，对痤疮杆菌抑制效果的研究，对痤疮治疗和面部皮肤护理具有重要意义。在体外抑菌实验方法的选择上，本实验运用了微量肉汤稀释法来考察20种清热类中药提取物对痤疮杆菌的体外抑菌活性。江丽等[2]的中药对痤疮致病菌的体外抑菌活性实验研究和朱亚芳和赵浩如[5]的中药体外抑制痤疮丙酸杆菌的活性测定中运用了琼脂平板稀释法。大部分中药提取物的颜色较深，凭借肉眼观察难以准确判断细菌在培养液中的生长情况，且中药提取物溶液在细菌培养过程中可能会析出一部分沉淀，会给观察带来一定的困难。本研究结果显示，知母、夏枯草、黄芩、半枝莲对痤疮杆菌有较好的抑菌作用，在进一步的实验中，可确定其MIC分别为0.360 9 g/L、6.25 g/L、3.125 g/L、3.125 g/L，则知母、夏枯草、黄芩、半枝莲在后续的药物筛选实验中可作重点考察对象，而栀子、赤芍、石膏等中药则没有表现出对痤疮丙酸杆菌有明显的抑菌作用，但这并不能因此而否定其的临床使用价值，可能通过其他方式发挥抑菌作用，其具体情况还需进一步考察。

表2 20种中药提取物对痤疮杆菌的抑制作用

表3知母、夏枯草、黄芩、半枝莲提取物对痤疮杆菌的抑制作用

参考文献：

[1]潘清丽,邵蕾,陈丽洁,等.痤疮发病机制的研究进展[J].皮肤性病诊疗学杂志,2018,25(6):377-380.

[2]江丽,单萍萍,申国庆,等.中药对痤疮致病菌的体外抑菌活性实验研究[J].药学与临床研究,2014,22(4):315-318.

[3]李焯轩,李明,黄小珊,等.肉桂油对致痤疮菌抑制作用的研究[J].广东药科大学学报,2018,34(6):57-61.

[4]周静,杜航,吴芳草,等.松油烯-4-醇体外抑制痤疮主要致病菌作用研究[J].中国病原生物学杂志,2018,13(2):160-163,167.

[5]朱亚芳,赵浩如.中药体外抑制痤疮丙酸杆菌的活性测定[J].药学与临床研究,2009,17(3):224-226.

黄健.20种清热类中药提取物对痤疮杆菌的抑制作用筛选[J].中国药物经济学,2020,15(05):42-45.