首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药炮制论文 > 艾灰黄酮超声提取工艺的优化及其抑菌活性

艾灰黄酮超声提取工艺的优化及其抑菌活性

2021-09-19 337 上传者：管理员

摘要：目的优化艾灰黄酮超声提取工艺,并考察其抑菌活性。方法在单因素试验基础上,以水浴温度、液料比、乙醇体积分数为影响因素,艾灰黄酮提取率为评价指标,响应面法优化提取工艺。采用滤纸片法,测定粗提液、发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用。结果最佳条件为水浴温度85℃,液料比50∶1,乙醇体积分数30%,艾灰黄酮提取率为1.092%。粗提液对3种细菌的MIC分别为3.130、6.250、3.130mg/mL,而发酵液为1.560、1.250、1.560mg/mL。粗提液对大肠杆菌的抑制作用最强,对金黄色葡萄球菌最弱;高质量浓度(10.00mg/mL)发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强,而在低质量浓度(2.50～5.00mg/mL)下对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强。结论该方法稳定可靠,可用于超声提取艾灰黄酮。该成分发酵液抑菌活性强于粗提液。

关键词：
响应面法
抑菌活性
滤纸片法
艾灰黄酮
超声提取
加入收藏

艾叶中主要含有挥发油、黄酮、鞣质、多糖等有效成分，具有温经、止血、散寒、去湿、止咳、消炎、抗过敏等多种功效[1,2],将其晒干捣碎得艾绒后制成艾条，可供艾灸用，它通过温热刺激来使局部皮肤充血，毛细血管扩张，促进炎症、粘连、血肿等病理产物消散吸收，起到行气通络、扶阳固脱、提高人体免疫力等作用，是中医传统防病治病方法[3,4,5]。

黄酮是一类拥有提高机体免疫力、防治心血管疾病等多种生理活性的化合物，有着广泛的抗氧化、抑菌活性[6,7,8],艾绒中也有大量该类成分[9]。艾灸产物有烟雾和灰烬，人们对前者研究较多[10,11,12,13],而鲜有涉及后者，文献[14,15]报道，艾灰在医疗保健方面有着广泛的用途，如治疗脚气、褥疮、疮疡出血等，其止血、清除自由基效果较艾叶更强。课题组前期对灸灰中有效成分进行提取后，发现其中仍有部分黄酮，其原因可能是艾灸过程中艾绒燃烧不充分所致。为进一步研究艾灸产物生物活性，本实验采用超声法提取艾灰黄酮，优化其提取工艺，并测试其粗提液、发酵液对3种革兰氏菌的抑制作用，以期为相关产物的开发利用提供依据。

1、材料

艾绒(陈艾)购自华夏艾灸网，经山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品。芦丁对照品(纯度>98%,编号PL-001X)购自中国计量院标准物质中心；茶多酚(纯度>98%,编号JP-0263)对照品购自今品化学技术(上海)有限公司。JP-030S型超声波清洗器购自深圳洁盟清洗设备有限公司；VIS-7220型光度计购自成都科析电子商务有限公司；LRH-150型恒温培养箱购自山东博科科学仪器有限公司；R-3001电动升降旋转蒸发仪购自郑州长城科工贸有限公司。大肠杆菌(CGMCC44568)、枯草芽孢杆菌(CGMCC10089)来源于中微保管理中心；金黄色葡萄球菌株(CGMCC26085)来源于中医保管理中心。安琪高活性酵母粉(安琪酵母股份有限公司)。无水乙醇、浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氯化钠、氢氧化钠等为分析纯(天津化学试剂厂)。

2、方法与结果

2.1 艾灰黄酮提取及其发酵液制备

将艾绒点燃，模拟艾灸的情景暗火燃烧后得艾灰，称取1g,加入一定量乙醇，超声处理一段时间后水浴加热浸提1h,2000r/min离心10min,取上层清液，在50～55℃下蒸出溶剂后得浓缩液，室温下晾干冷藏。在上述提取液(浓缩前)中加入0.1g酵母粉，于30℃恒温箱中发酵16h,即得发酵液，冷藏备用。

2.2 艾灰黄酮含量测定

2.2.1 线性关系考察

按文献[16]报道的方法，以芦丁质量浓度为横坐标(X),吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=13.26X+0.004500(R2=0.9928),在0～0.04000mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2 提取率测定

按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，公式为艾灰黄酮提取率=黄酮质量艾灰质量×100%。

2.2.3 稳定性试验

按文献[17]报道的方法配制0.1000mg/mL芦丁对照品溶液，静置0、2、4、6、8、10h后按“2.2.1”项下方法测定吸光度，测得其RSD为0.1640%,表明溶液在10h内稳定性良好。

2.2.4 精密度试验

取0.1000mg/L芦丁对照品溶液，按“2.2.1”项下方法连续测定吸光度6次，测得其RSD为0.6340%,表明仪器精密度良好。

2.2.5 加样回收率试验

取9份0.03240mg/L艾灰粗提液(或发酵液)各10mL,加入0.04520、0.03240、0.02170mg/L芦丁对照品溶液各10mL,75%乙醇定容至50mL,按“2.2.1”项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率为100.267%,RSD为1.260%。

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数

取艾灰1g,设定液料比为30∶1,乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%,超声振荡30min,在80℃恒温水浴中提取1h,离心，取上层清液，定容至100mL,按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图1。由此可知，提取率随着乙醇体积分数增加而升高，其原因是黄酮极性与乙醇相当，后者体积分数增大有利于前者溶出，在70%时最高，为0.7000%;但乙醇体积分数进一步增大时，艾灰中亲脂性成分也会随之溶出，导致提取率反而降低。因此，确定乙醇体积分数为70%。

2.3.2 液料比

取艾灰1g,设定乙醇体积分数为70%,液料比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1,超声振荡30min,在80℃恒温水浴中提取1h,离心，取上层清液，定容至100mL,按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图2。由此可知，随着乙醇用量增加，艾灰浸润程度逐渐加强，溶剂传质作用提升[18],从而使艾灰黄酮释放量升高，液料比为30∶1时最高；但乙醇用量进一步增加时，脂溶性杂质也会随之溶出，导致黄酮提取率降低。因此，确定液料比为30∶1。

2.3.3 超声时间

取艾灰1g,设定乙醇体积分数为70%,液料比为30∶1,超声时间分别为15、20、25、30、35、40min,在80℃恒温水浴中提取1h,离心，取上层清液，定容至100mL,按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图3。由此可知，当超声时间在15～30min时，提取率随着超声时间延长而升高，在30min时达到最高，其原因是超声波具有较强的声冲流和声空化作用，能加速细胞壁的破碎[19],从而使黄酮溶出率增大；但超声时间进一步延长时，杂质溶出量也会随细胞壁破碎度的增加而升高，导致黄酮提取率降低。因此，确定超声时间为30min。

2.3.4 水浴温度

取艾灰1g,设定乙醇体积分数为70%,液料比为30∶1,超声时间为30min,水浴温度分别为40、50、60、70、80、90℃,恒温提取1h,离心，取上层清液，定容至100mL,按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图4。由此可知，水浴温度在40～70℃时黄酮提取率随着其增加而升高，在70℃时达到最高，为1.037%;但水浴温度进一步升高时，黄酮结构会被破坏[20],导致黄酮提取率降低。因此，确定水浴温度为70℃。

2.4 响应面法优化

单因素试验结果表明，水浴温度(A)、液料比(B)、乙醇体积分数(C)对艾灰黄酮提取率(Y)的影响较大，故选择三者进行响应面试验，因素水平见表1,结果见表2。

对表2数据进行拟合，得方程为Y=0.7600+0.05900A+0.03300B-0.09200C-4.725×103AB-0.2000AC-0.1300BC-0.02400A2-0.2400B2+0.01400C2,方差分析见表3。由此可知，模型失拟项P>0.05,表明失拟不显著；决定系数R2=0.9956,相关系数R2Adj=0.9932,表明模型准确度较高[21];CV为4.620%,表明模型可信度较高；F值越大，变量对响应值的影响越大[22],故各因素影响程度依次为乙醇体积分数(C)>水浴温度(A)>液料比(B),并均有显著差异(P<0.05,P<0.01)。

响应面图反映了各因素对响应值的影响程度，而等高线反映了其相互作用强度[21]。图5显示，液料比、水浴温度曲线较陡，即对响应值的影响较大；乙醇体积分数的响应面曲线则相对平缓，即对响应值的影响较小；水浴温度、乙醇体积分数等高线的两两交互作用较显著，曲线呈椭圆形，而其余等高线接近圆形，即两两交互作用不显著。

结果表明，最优提取条件为水浴温度84.36℃,液料比48.51∶1,乙醇体积分数30.22%,艾灰黄酮提取率1.105%,根据实际情况，将其修正为水浴温度85℃,液料比50∶1,乙醇体积分数30%。再进行3次验证试验，测得艾灰黄酮平均提取率为1.092%,与预测值1.105%的偏差仅为0.01300%,表明模型稳定可靠，拟合度良好。

2.5 抑菌活性实验

2.5.1 药液制备

将0.001000g酵母加到10mL0.1000g/mL提取液中，于28℃下恒温培养48h后得发酵液，冷藏。50%乙醇配制艾灰黄酮粗提物、发酵液、芦丁、茶多酚供试液(0.1000g/mL),采用二倍稀释法，蒸馏水稀释至20.00～1.560、10.00～1.250mg/mL,即得。

2.5.2 菌种扩培与含菌培养基制备

被测菌株按文献[23]报道的方法扩培，吸取1×108CFU/mL菌悬液1mL至BPDA培养基中，涂布均匀，于30℃恒温箱中培养1h,即得。

2.5.3 抑菌实验

将相同直径的滤纸片在供试液中浸泡15min后，均匀放置在含菌培养皿中(每皿3个，分别为无菌水、艾灰黄酮粗提液及同浓度发酵液),同一温度下培养72h后观察，平行3次，取平均值，计算抑菌圈直径，公式为抑菌圈直径=抑菌圈外径-滤纸片直径。再移取菌悬液0.1000mL、不同质量浓度被测液各1mL,加到灭菌冷却后的培养基上，涂布均匀后恒温培养，观察不同条件下菌落生长情况，以粗提液、发酵液不长菌的最低质量浓度为最低抑菌浓度(MIC)[24]。

2.5.4 统计学分析

采用Origin8.0软件处理数据，再通过SPASS17.0软件进行统计学分析。

2.5.5 结果分析

表4～5显示，发酵液对3种细菌的抑制作用均强于粗提液，其中粗提液对大肠杆菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌最弱，并均弱于茶多酚、芦丁；发酵液在高质量浓度(10.00mg/mL)下对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，而低质量浓度(2.500～5.000mg/mL)时对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强；当发酵液质量浓度为5.000mg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于芦丁，而为2.500mg/mL时对3种细菌的抑制作用均强于茶多酚、芦丁。

3、讨论与结论

艾灰黄酮最佳超声提取工艺为乙醇体积分数30%,液料比50∶1,超声振荡30min后在85℃恒温水浴中提取1h,提取率为1.092%,与预测值(1.105%)偏差仅为0.01300%,表明模型拟合度良好。

抑菌活性实验结果表明，艾灰黄酮粗提液、发酵液均对待测菌株有一定抑制作用，并且后者明显更强，其原因可能是发酵有利于该成分含量的提升[25];发酵液抑菌效果受药液浓度的影响较小，在2.500mg/mL时的作用与对照药芦丁、茶多酚在5.000mg/mL时的相当，可见发酵对提高其活性非常有效，以发酵液代替提取液可有效降低药液使用量。值得注意的是，发酵液中黄酮含量会因发酵条件不同而发生变化[26],故后期应对上述方面进行更深入的探究。

参考文献:

[1]张潇予,薛澄,李瑞,等.艾叶干燥､存储､加工过程中挥发性成分的变化规律研究[J].中药材,2020(6)1349-1352(2020-07-07)(2021-06-25).

[5]张元,康利平,郭兰萍,等.艾叶的本草考证和应用研究进展[J].上海针灸杂志,2017,36(3):245-255.

[6]张美娜.提取工艺对山茶油活性成分及抑菌效果的影响[J].食品与机械,2019,35(1):177-180.

[7]李芳,魏云,陈艳杰.铁皮石斛茎､叶､花中黄酮含量及其体外抗氧化活性研究[J].中医学报,2019,34(5):1020-1023.

[8]王慧芳,苏淑云,邵圣娟,等.大孔树脂分离纯化陈皮黄酮工艺及其抑菌活性[J].中成药,2018,40(12):2667-2672.

[9]韩明娟.蕲春艾绒与南阳艾绒灸治膝骨关节病的临床疗效差异及作用机制研究[DJ.北京:中国中医科学院,2018.

[10]韩丽,胡海,刘平,等.不同浓度的艾烟对昆明小鼠的急性毒性研究[J].中华中医药杂志.2017,32(2):.731-734.

[11]吴子建,王斌,段文秀,等.顶空进样-气相色谱-质谱联用法检测3年陈艾条燃烧产物中挥发性成分[J].安做中医药大学学报,2017,36(2):64-67.

[12]杨梅,江丹,易筠,等.艾叶燃烧物清除自由基作用的观察[J].中国针灸,2009,29(7):547-549.

[14]刘磊,胡玲,王璐璐,等.艾灸生成物的研究进展[J].云南中医学院学报,2018,41(2):95-98.

[15]郑婷婷,田瑞昌,刘国辉,等.艾叶及其燃烧产物有效成分的研究进展[J].中华中医药杂志,2019,34(1);241-244.