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不同提取工艺、蛋品蛋黄油的质量评价及3种磷脂同时测定

2021-09-19 181 上传者：管理员

摘要：目的对不同提取工艺、蛋品蛋黄油进行质量评价,并同时测定3种磷脂含量。方法分别采用干馏法、乙醇提取法、专用分离仪法、专用分离仪法+乙醇提取法提取蛋黄油。分析采用VenusilXBPSilica色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相甲醇-水(90∶10);体积流量0.8mL/min;漂移管温度66℃;雾化气空气,体积流量1.8L/min;增益4。结果专用分离仪法提取的蛋黄油性状较佳,呈黄棕色半透明状,较黏稠,蛋香味浓,并且土鸡蛋提取时质量较好,收率较高。不同蛋品卵磷脂含量差异较大,其中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺含量较高,溶血磷脂酰乙醇胺较低。3种磷脂在各自范围内线性关系良好(r≥0.9990),平均加样回收率95.40%～105.71%,RSD≤3%。结论专用分离仪法具有实用性、创新性,与乙醇提取工艺相结合时能显著提高蛋黄油质量,可应用于工业化生产。HPLC-ELSD法简便准确,重复性好,可为蛋黄油质量评价和控制提供参考依据。

关键词：
HPLC-ELSD
提取工艺
溶血磷脂酰乙醇胺
磷脂酰乙醇胺
磷脂酰胆碱
蛋品
蛋黄油
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蛋黄油为雉科动物家鸡鲜卵的卵黄提取物，具有消肿解毒、敛疮生肌的功效，临床上用于烫火伤、湿疹、皮肤瘙痒等病[1],主要含有脂肪、蛋白质氨基酸、维生素、矿物质[2],其中脂肪类主要包括磷脂类、脂肪酸类[3]。蛋黄磷脂主要由磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和少量的溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、鞘磷脂(SM)等组成，在医药原料、抗氧化、降血脂、增强记忆等方面得到广泛的应用[4],是一种较好的生物活性物质。

蛋黄油质量决定于鸡蛋质量及提取工艺，目前关于其提取工艺的报道较多，如干馏法、有机溶剂法、超临界CO2萃取法[5]等。课题组经十余年探索实验，设计出一种新的蛋黄油提取工艺(分离法),收录于2009年版《湖南省中药材标准》[1],该方法简单实用，已实现批量生产能力，并且与乙醇提取工艺相结合时能显著提高蛋黄油的质和量。

目前，磷脂类成分的分析检测方法主要有薄层色谱、薄层扫描色谱[6]、高效液相色谱(HPLC)[7]、紫外可见吸收光谱[8],其中HPLC法应用广泛，操作简便，灵敏度高，故磷脂分析大多该方法[9]。蛋黄油在2001年版《黑龙江省中药材标准》[10]、2009年版《湖南省中药材标准》、2015年版《四川省中药饮片炮制规范》[11]等中均有收录，但均未建立相应的含量测定指标，故本实验采用HPLC-ELSD法同时测定蛋黄油中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺3种磷脂类成分的含量，以期为其质量评价和控制提供参考依据。

1、材料

1.1 仪器

Agilent1200色谱仪(美国Agilent公司);Alltech3300蒸发光检测器(美国Grace公司);OptionR7utraAN超纯水系统(英国Elga公司);KQ5200DV数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);CP224C分析天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司];分离仪(自制)。

1.2 试剂与药物

不同品种鸡蛋购自于湖南、贵州、河北、江西、湖北等地。磷脂酰胆碱PC(纯度≥98%,批号190064-201902)、溶血磷脂酰乙醇胺LPE(纯度≥98%,批号190024-201804)对照品均购于中国食品药品检定研究院；磷脂酰乙醇胺PE(纯度≥98%,批号1002386399)对照品购于美国Sigma公司。甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2、方法与结果

2.1 不同提取工艺蛋黄油比较

取同一批鲜鸡蛋，煮熟后手工取出蛋黄，研粉，置于烤箱中烤干，各称900g,分别采用干馏法、95%乙醇提取法、专用分离仪法、专用分离仪法+乙醇提取法进行提取，从蛋黄油外观(颜色、气味、透明度、性状)、收率[(蛋黄油质量/干燥蛋黄粉质量)×100%]两方面进行比较，结果见表1。由此可知，专用分离仪法+乙醇提取法提取时收率较高，达54.9%,其余3种提取方法差别不大；不同提取方法下外观性状有较大差异，以专用分离仪法、专用分离仪法+乙醇提取法提取者较佳。

2.2 不同蛋品蛋黄油比较

2.2.1 鸡蛋

品系因素在生物进化中具有十分重要的意义，而且鸡肉、鸡蛋所含的人体必需氨基酸、脂肪酸等成分随着鸡种及饲养方法的不同而有所差异，甚至是有或无的区别[5]。因此，不同品质鸡蛋所提取出的蛋黄油质量差异较大。

为了鉴别土鸡蛋与饲料蛋[12],课题组进行了初步研究，发现好的土鸡蛋个小、壳厚中、壳衣厚、黄大质紧、呈金黄色、味香，见表2。鲜蛋水煮后有一定的吸水性，鸡品好的鸡蛋较明显；蛋黄与蛋白质量比重越大，一般说明蛋品质量越好；含水量越高，有形成分越少，鸡蛋质量越差。称取各品种生鲜鸡蛋5kg,浸冷水中煮沸15min后再浸入冷水中10min,捞起滤水5min后称定质量，再手工剥离蛋黄、蛋白、蛋壳称定质量，蛋黄、蛋白压碎后与蛋壳分别置于100℃烘箱中，注意定时翻搅，以感觉完全干燥后称定质量，结果见表3,可知蛋黄比重依次为湖南怀化雪峰乌骨鸡蛋>贵州思南土鸡蛋>湖南辰溪绿壳鸡蛋>河北承德养殖场鸡蛋，含水量依次为湖南怀化雪峰乌骨鸡蛋<贵州思南土鸡蛋<湖南辰溪绿壳鸡蛋<河北承德养殖场鸡蛋。

2.2.2 蛋黄粉

“2.2.1”项下结果显示，不同品质鸡蛋蛋黄比重及性状都存在差异，质量好的鸡蛋蛋黄大、呈金黄色、质紧、富有弹性，推测不同蛋品所得蛋黄粉质量可能也会有所区别。取不同鸡蛋各1kg,水煮熟取蛋黄各10个，考察其外观、收率，进行加压实验(玻璃块下压1.0cm,以蛋黄裂开为标准，3个以内柔性较差，3个以上柔性差，无裂开柔性好),发现优质土鸡蛋制作的蛋黄粉呈金黄色，颗粒细小，柔性良好，油腻感明显，烘烤时香味浓郁，收率高，见表4。

2.2.3 蛋黄油

为了探讨鸡蛋质量与蛋黄油品质及提取产量之间是否存在相关性，本实验对不同蛋品提取蛋黄油品质、收率进行考察，发现湖南怀化雪峰乌骨鸡蛋、贵州思南土鸡蛋所提取的蛋黄油呈黄棕色，蛋香味浓郁；湖南辰溪绿壳鸡蛋、河北承德饲料鸡蛋所提取的蛋黄油呈淡黄色，蛋香味较淡。表5显示，不同蛋品提取蛋黄油的收率有所差异，表明鸡蛋质量与蛋黄油提取产量有相关性，以蛋品质量佳的湖南怀化雪峰乌骨鸡蛋最高。

2.3 HPLC-ELSD法同时测定3种磷脂含量

2.3.1 色谱条件

VenusilXBPSilica色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相甲醇-水(90∶10);体积流量0.8mL/min;漂移管温度66℃;雾化气空气，体积流量1.8L/min;增益4;进样量10μL。色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取各对照品适量，甲醇制成444、278、907μg/mL,即得。

2.3.3 供试品溶液制备

取蛋黄油约0.075g,精密称定，溶于三氯甲烷-甲醇(1∶1)中，超声(40kHz、200W)处理15min,放冷，三氯甲烷-甲醇(1∶1)定容至25mL,0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 线性关系考察

精密吸取各对照品适量，甲醇稀释至不同质量浓度，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积(Y)对对照品质量浓度(X)进行回归，结果见表6。

2.3.4.2 精密度试验

取对照品溶液适量，在“2.3.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱峰面积RSD分别为1.49%、2.06%、2.45%,表明仪器精密度良好。

2.3.4.3 稳定性试验

取供试品溶液(湖北黄冈土鸡蛋)适量，于0、2、4、8、12、24h在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱峰面积RSD分别为1.78%、2.59%、1.64%,表明溶液在24h内稳定性良好。

2.3.4.4 重复性试验

精密称取湖北黄冈土鸡蛋6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱含量RSD分别为2.57%、1.96%、2.13%,表明该方法重复性良好。

2.3.4.5 加样回收率试验

取湖北黄冈土鸡蛋约0.0375g,精密称定，共6份，加入适量对照品溶液，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表7。

2.3.4.6 样品含量测定

精密称取不同蛋品蛋黄油各0.075g,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，见表8。

3、讨论与结论

蛋黄油提取工艺直接影响其质量，本实验以专用分离仪提取后其性状理想，收率为35%,再将分离后蛋黄渣用95%乙醇提取，总收率可达60%。目前，尚无采用专用分离仪提取蛋黄油的报道，故本实验中的提取方法具有一定实用性、创新性，并与乙醇提取工艺相结合，现已完成中试并批量生产，有望应用于工业化生产中。另外，鸡蛋质量与蛋黄油质量紧密相关，本实验发现优质土鸡蛋蛋黄大而质紧，呈黄红色或金黄色，蛋香味浓，不仅产量高，而且质量好。

本实验采用HPLC法测定蛋黄油中磷脂类成分含量，并考察了不同检测器(UV、ELSD)、流动相体系(甲醇-水、正己烷-异丙醇-水)分离情况，发现采用ELSD检测器、甲醇-水体系时该类成分分离度较好，同时考察了不同体积流量(0.6、0.8、1.0、1.2mL/min)、柱温(25、30、35、40℃),发现体积流量、柱温对其影响不大。结果表明，不同产地、品种鸡蛋的蛋黄油中磷脂酰胆碱含量均最高，磷脂酰乙醇胺次之，溶血磷脂酰乙醇胺最低，而且采用相同提取方法时不同蛋品蛋黄油中三者含量有所差异；同一蛋品采用不同提取工艺时，S2(乙醇提取法)中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱含量最高，S1(干馏法)中未发现磷脂类成分，表明产区环境生态因子、蛋品质量、不同提取工艺对蛋黄油中磷脂类成分含量有较大影响。

综上所述，该方法简便准确，重复性好，有望为蛋黄油质量评价和控制提供可靠的检测方法，同时为探讨鸡蛋品质形成机制提供基础资料。

参考文献:

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[10]黑龙江省食品药品监督管理局.黑龙江省中药材标准(2001年版)[S].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,2001:221-223.