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光甘草定纳米脂质体的制备及甘油对其性能的影响

2021-09-19 1145 上传者：管理员

摘要：目的制备光甘草定纳米脂质体,并考察甘油对其性能的影响。方法采用超声辅助-薄膜分散法制备纳米脂质体,分析甘油对其外观形态、粒径、载药量、包封率、体外透皮、体外DPPH自由基清除率的影响。结果所得纳米脂质体呈类球形,平均粒径在100～150nm范围内,载药量约为2.5%,包封率高于70%,体外DPPH自由基清除率高于60%,渗透速率为4.64μg/（cm2•h）并且无时滞。结论甘油对光甘草定脂质体性能的影响较小。

关键词：
光甘草定
甘油制备
皮肤渗透性
纳米脂质体
超声辅助－薄膜超声法
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光甘草定是来源于豆科植物光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的异黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、神经保护、抗动脉粥样硬化、调节能量代谢等广泛的药理作用[1],尤其是能有效抑制酪氨酸酶活性，在化妆品领域享有“美白黄金”之称[2],将其用于治疗银屑病等常见皮肤病的相关研究[3]也日趋增加。但光甘草定水溶性低(25℃时仅为0.10mg/L),脂溶性强(logP=4.85)[4],故如何改善其溶解性、提高其皮肤渗透性而获得理想的治疗或美肤效果引起了广泛关注。

目前，通常采用添加促渗剂[5]或新型纳米制剂技术(纳米乳[6]、脂质体[7,8]、纳米结晶[9]、环糊精包合物[10]等)等手段促进光甘草定透皮吸收，其中纳米脂质体不具有良好的皮肤相容性、渗透性、滞留性[11],但不同脂质体配方可能影响其形态和性能，进而导致经皮渗透行为的差异[12]。甘油作为常见的外用制剂和化妆品添加剂之一，自身具有优良的保湿性能，但脂质体配方中添加该成分后对其成型和性能影响的报道较少。因此，本实验采用常见的薄膜分散法[13]制备光甘草定甘油脂质体，并考察处方中添加甘油与否对其载药、形态、透皮性能、体外抗氧化作用的影响，以期为相关后继产品研发奠定基础。

1、材料

1.1 试剂与药物

光甘草定原料药(纯度40%,南京景竹生物科技有限公司，JZ20140412)。蛋黄卵磷脂(上海太伟药业有限公司，20140518);胆固醇(北京百灵威科技有限公司，LG50O54);甘油(天津市大茂化学试剂厂，20141012)。其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

1.2 仪器

细胞超声破碎仪(型号JY99-ⅡDN,宁波新芝生物科技有限公司);旋转蒸发仪(型号THZ-100B,上海一恒科学仪器有限公司);电子天平(型号ABS210S,德国Sartorius公司);水浴锅(型号QL-861,海门市其林贝尔仪器制造有限公司);高效液相色谱仪(型号Modl-L2000)、透射式电子显微镜(型号H-7650)(日本日立公司);亚微粒径分析仪(型号Nicomptm380,美国PSS公司);药物透皮扩散试验仪(型号RYJ-12B,上海黄海药检仪器有限公司)。

2、方法与结果

2.1 光甘草定纳米脂质体制备

称取光甘草定25mg、卵磷脂300mg、胆固醇40mg,置于茄形瓶中，加入8mL三氯甲烷，充分溶解后旋转蒸发仪挥干三氯甲烷，加入10mL水性介质(处方A为纯水，处方B为10%甘油)水化30min,35℃下搅拌1h,400W下超声处理5min(每工作5s停止2s),即得。

2.2 载药量、包封率测定

取适量纳米脂质体，置于10mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取20min后甲醇定容，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，采用HPLC法测定光甘草定含量[9],计算载药量。分析采用YMC-PackProC18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm);流动相乙腈-0.44%冰乙酸(62∶38);体积流量1.0mL/min;柱温30℃;检测波长282nm。

另取适量纳米脂质体，置于离心管中，高速(16000r/min)离心15min后取上清液，适当稀释作为供试品溶液，同法测定游离药物含量，计算包封率。结果见表1。由此可知，处方A、B载药量均约为2.5%,包封率均大于70%,大多数粒径在100～200nm范围内，其中处方B载药量、包封率略低，粒子粒径大，但分布较窄。

2.3 形态、粒径表征

处方A、B经适当稀释后，分别采用激光粒度仪测定其平均粒径和多分散指数(PDI),结果见表1。另将稀释后的纳米脂质体滴于300目铜网表面，1%磷钨酸溶液染色后通过透射电子显微镜(TEM)观察其形态和结构特征，结果见图1,可知处方A、B均呈不规则类球形的多层囊状体，粒径均小于200nm,多数在100nm左右，并且较为均匀。

2.4 大鼠离体皮肤透过性能研究

大鼠腹部皮肤指定区域利用剪刀、理发器除去毛发，涂擦10%硫化钠溶液脱去细毛[12,13],立即用生理盐水反复清洗干净。24h后处死，取下脱毛部位鼠皮，小心剥除皮下脂肪和结缔组织，生理盐水浸洗后备用。

离体皮肤透过性能采用Franze扩散池，在32℃、500r/min下进行测试。将大鼠皮肤角质层向上，固定于接收池和扩散池之间，加入乙腈-pH7.4PBS(40∶60)作为接收液[14],将适量纳米脂质体均匀涂于大鼠皮肤表面，在预定时间点(l、2、3、4、6h)各取样1.0mL,立即补充等量同温接收液。

样液过滤后取续滤液作为供试品溶液，采用HPLC法测定含量，计算单位面积累积渗透量Qt,稳态渗透速率Js、渗透系数P,公式分别为Qt=CnV+∑n−1i=1CiViA、Js=dQdT、P=JsCd,其中V为接收液体积(6.5mL),Vi为取样量，Cn为第n次取样时接收液中药物质量浓度，Ci为第i次取样时接收液中药物质量浓度，Cd为扩散池中药物质量浓度，A为有效渗透面积(2.89cm2)。绘制累积渗透曲线，再经线性回归处理，所得方程的斜率即为经皮渗透速率Js,在横线上的截距即为药物经皮渗透的时滞Tlag,结果见图2、表2。

2.5 抗氧化活性研究

配制0.1mmol/LDPPH乙醇溶液，密封避光保存备用，另配制0.5mg/mL维生素C溶液作为对照。取纳米脂质体溶液、DPPH溶液各2mL,加到同一试管中，摇匀，室温下避光静置30min后测定吸光度(A样品);取维生素C溶液、DPPH溶液各2mL,混合后测定吸光度(A对照),计算清除率，公式为清除率=(1-A样品/A对照)×100%,结果见图3。由此可知，处方B对DPPH自由基的清除活性为68.7%,略高于处方A的60.6%,但清除率均低于维生素C的88.1%。

3、讨论

在脂质体制备过程中，可加入表面活性剂、乙醇(或丙二醇)、挥发性萜类化合物、甘油等来制成相应传递体、醇质体、萜质体、甘油体等新型脂质体，提高其亲和力、变形性、稳定性，并进一步改善载体透皮促渗性能[15]。研究表明，某些中药活性成分(挥发油、冰片等)自身也能影响脂质体透皮性能[16]。

本实验在制备光甘草定脂质体时，加入了一定量甘油，发现包封率略有降低，其原因可能是甘油能一定程度上改善光甘草定在水性体系中的溶解度(该成分在甘油中的溶解度约为70mg/g[14]),进而在脂质体成型过程中产生影响。体外透皮实验结果表明，甘油加入可提高脂质体给药后初期对皮肤的渗透能力，而给药1h后光甘草定在离体鼠皮上的累积渗透率达3.73μg/cm2,约为处方A的2倍，其原因可能与处方B所得制剂与皮肤亲和力、变形性的改善有关[8,17],但这种渗透优势未能延续至后期，可能与该处方载药量较低有关。

综上所述，本实验采用薄膜超声法制得的光甘草定纳米脂质体粒径小而均匀，而甘油加入对其外观形态几乎无影响，但其载药特性、体外透皮、自由基清除率均存在一定差异。

参考文献:

[1]谢琳琳,高振珅,周宏,等.光甘草定的提取分离方法､检测方法及其制剂的研究进展[J].中国药房,2018,29(21);3009-3013.

[2]李想,李冀.甘草提取物活性成分药理作用研究进展[J].江苏中医药,2019,51(5):81-86.

[3]徐玉婷.光甘草定提取纯化及抗银屑病作用和机理研究[D].广州:广东工业大学,2017.

[4]冯倩茹,叶柳青,刘园园,等.光甘草定平衡溶解度和油水分配系数的测定[J].天津中医药大学学报,2017,36(1):54-56.

[5]王艳,叶柳青,刘园园,等.氢化胡椒碱对光甘草定软有透皮渗透性的影响[J].天津中医药,2016,33(3):177-181.

[6]苏润萍.光甘草定带正电荷纳米乳的研制[D].长春:吉林大学,2018.

[7]黄金龙,何新华.光甘草定脂质体制备及其质量评价[J].生物质化学工程,2016,50(3).8-12.

[8]李霞.神经酰胺ⅢB纳米脂质体和光甘草定纳米脂质体的制备及透皮给药研究[D].武汉:华中科技大学,2016.

[9]胡进.光甘草定纳米结晶凝胶剂的制备与评价[D].银川:宁夏医科大学,2016.

[10]叶柳青,王艳,韩宛盈,等.光甘草定羟丙基-β-环糊精包合物的制备及其对透皮吸收的影响研究[J].天津中医药,2015,32(10):622-625.