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离子液体辅助提取牡丹皮中丹皮酚工艺的优化

2021-09-22 132 上传者：管理员

摘要：目的优化离子液体辅助提取牡丹皮中丹皮酚工艺。方法分别采用水蒸气蒸馏法和回流法,考察水、水-NaCl、水-离子液体体系和水、水-离子液体体系对丹皮酚提取率的影响,并进一步研究离子液体加入方式、种类、浓度对丹皮酚提取率的影响。结果最佳条件为辅助提取剂[OMIM]Br,离子液体与水比例1∶3,液料比10∶1,回流提取2次,KPF6除去[OMIM]Br,提取液萃取剂乙酸乙酯。离子液体-水-煎煮法能提高丹皮酚提取率,而离子液体-水-水蒸气法能获得大量挥发油,但丹皮酚含量很低。结论将离子液体用于牡丹皮中丹皮酚的提取时,具有操作方法简单、提取率高、损失小等优点。

关键词：
丹皮资源
丹皮酚
提取工艺
牡丹皮
离子液体辅助提取
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丹皮酚具有抑菌抗炎[1,2]、抗肿瘤[3,4,5]、增强免疫功能[6]等作用，在国际市场上售价较高。虽然我国丹皮资源丰富，但传统提取工艺存在提取损失大、提取成本高等不足[7],导致资源浪费。

离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的熔融盐[8],具有热稳定性好、蒸气压低、溶解能力强等优点[9,10,11,12,13,14,15,16,17],已用于有机合成[10,11]、电化学[12]、生物工程[13]、萃取技术[14,15,16,17]等领域。另外，离子液体结构的可设计性也可用于天然产物活性成分的提取与分离[18,19]。

本实验研究了水蒸气蒸馏法、回流法，不同溶剂体系及离子液体加入方式、种类、浓度对丹皮酚提取率的影响，发现[RMIM]Br-水体系回流(煎煮)时丹皮酚提取率最高；离子液体-水-水蒸气蒸馏法能够获得大量挥发油，但丹皮酚含量极低，并且水蒸气蒸馏法不能获得此结果。与传统提取工艺相比，离子液体辅助提取牡丹皮中丹皮酚、挥发油具有操作简单、节约资源、节约能源等优点[7],值得工业化推广。

1、材料

1.1 试剂与药物

1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br)、1-甲基-3-己基咪唑溴([HMIM]Br)、1-甲基-3-辛基咪唑溴离子液体([OMIM]Br)均为自制。丹皮酚对照品(批号Y27F7Y17002,上海源叶生物科技有限公司)。牡丹皮(市售)经西安医学院药学院生药教研室张彦老师鉴定为芍药科植物牡丹PaeouiaSuffruicoatAndr.的干燥根皮。六氟磷酸钾(分析纯，萨恩化学技术有限公司);甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2 仪器

LC-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);调温型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司);SB-5200DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2、方法与结果

2.1 牡丹皮中丹皮酚的提取

2.1.1 水蒸气蒸馏法

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，加10倍量水超声处理15min,加热蒸馏，收集馏出液，冷却至室温，置于4℃冰箱中冷藏24h,滤过，25℃下干燥称重，即得丹皮酚晶体。取3份药材，同法提取3次，即得提取物晶体。

2.1.2 水-NaCl水蒸气蒸馏法

2.1.2.1 不同加盐量

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，加10倍量水，再分别加入0、0.5、0.75、1.0、1.25gNaCl超声处理15min,加热蒸馏，收集馏出液，冷却至室温，置于4℃冰箱中冷藏24h,洗涤，滤过，25℃下干燥称重，即得提取物晶体。每种方法各称取3份药材，同法提取3次。

2.1.2.2 不同浸泡时间

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，加10倍量水，在加入0.75gNaCl分别浸泡1、2h后超声处理15min,加热蒸馏，收集馏出液，冷却至室温，置于4℃冰箱中冷藏24h,洗涤，滤过，25℃下干燥称重，即得提取物晶体。每种方法各称取3份药材，平行提取3次。

2.1.3 水-离子液体水蒸气蒸馏法

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，按液料比10∶1进行提取(离子液体与水比例1∶9),精密量取5.00mL[OMIM]Br至圆底烧瓶中，先浸泡30min,再加45mL蒸馏水超声处理15min,加热蒸馏提取，馏出液于4℃冰箱中冷藏24h,同法操作3次，即得离子液体浸泡后加水、水-离子液体浸泡后的油状提取物。

2.1.4 水体系回流

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，按液料比10∶1进行提取，超声处理15min,加热回流提取2次，每次1h,合并滤液，于水浴锅上浓缩至适量。

2.1.5 [RMIM]Br-water体系回流

2.1.5.1 不同离子液体种类

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，按液料比10∶1进行提取(离子液体与水比例1∶9),精密量取5.00mL[RMIM]Br(R=butyl、hexyl、hexyl)至圆底烧瓶中，浸泡30min,再加45mL蒸馏水超声处理15min,加热回流提取2次，每次1h,合并滤液，于水浴锅上浓缩至适量。

2.1.5.2 不同离子液体浓度的选择

取药材5g,置于250mL圆底烧瓶中，液料比为10∶1,分别按离子液体与水比例1∶15、1∶12、1∶6、1∶3进行提取，精密量取不同体积[OMIM]Br至圆底烧瓶中，浸泡30min后加入不同体积蒸馏水超声处理15min,再加热回流提取2次，每次1h,合并滤液，于水浴锅上浓缩至适量。

2.2 溶液制备和色谱条件

2.2.1 对照品溶液

精密称取丹皮酚对照品10.12mg,置于25mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液

[RMIM]Br-water体系按[RMIM]Br与KPF6比例1∶1加入KPF6,乙酸乙酯反复洗涤，收集乙酸乙酯层，除去溶剂后甲醇定容至25mL量瓶中，分别精密吸取1.00mL,甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，即得。

2.2.3 色谱条件

AgilentHC-ODS(2)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相甲醇-水(60∶40);体积流量1mL/min;检测波长274nm;进样量10μL。

2.3 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL,置于10mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.2.3”项色谱条件下各进样10μL测定。以吸光度为纵坐标(A),丹皮酚质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=35.794X+241.30(r=0.9991),在20.44～408.8μg/mL范围内线性关系良好。

2.4 丹皮酚含量测定

根据2020版《中国药典》附录《药品质量标准分析方法验证指导原则》要求，采用外标法测定丹皮酚含量。

2.4.1 水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏得到的丹皮酚晶体熔点为49.8℃,而文献报道其范围在49～51℃之间，故本实验所得为纯品。浸泡时间为0、1、2h时，丹皮酚质量分别为63.10、44.40、42.0mg,即不浸泡时效果最佳，见图1。

2.4.2 水-离子液体水蒸气蒸馏法

取5g药材，离子液体浸泡后分别加水、水-离子液体浸泡，水蒸气蒸馏法得油状提取物，平行3次，得油状物。

2.4.3 水-离子液体体系回流法

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液10.0μL,在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，结果见图2,丹皮酚提取量见图3。

2.4.4 不同浓度离子液体体系回流法

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液10.0μL,在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，结果见图4,丹皮酚提取量见图5。

3、讨论与结论

由图1可知，NaCl-水蒸气蒸馏法提取时最优工艺为5g药材加入15%NaCl、10倍量蒸馏水，不浸泡直接超声处理15min,表明NaCl的存在可减弱丹皮酚在水中的溶解度，易于结晶析出。由图2、4可知，HPLC法对丹皮酚提取结果进行实时检测时，能快速获得不同溶剂体系、不同浓度离子液体体系对丹皮酚提取率的影响。由图3可知，选择1-辛基-3-甲基咪唑溴([OMIM]Br)作为离子液体时丹皮酚提取率最高。另外，由于[RMIM]Br离子液体随着烷基链长的增长疏水性增加，故在疏水性成分丹皮酚的物质传递过程中，[OMIM]Br传质能力强于[HMIM]Br、[BMIM]Br。

在水蒸气蒸馏提取过程中，[OMIM]Br浸泡后加水时油状提取物质量为946.7mg,而[OMIM]Br-水浸泡油状物的质量为688.3mg。经HPLC法分析发现，该油状提取物中丹皮酚含量很低，也低于传统水蒸气蒸馏提取，其原因可能为离子液体有破坏细胞壁和纤维素的能力，有利于挥发油释放，但加水稀释后上述作用减弱，导致其含量降低。

在离子液体-水-水蒸气蒸馏法提取丹皮酚过程中，大量油状物被馏出，并且冷藏静置后无结晶析出。经HPLC法分析发现，挥发油中丹皮酚含量很低，其原因可能为离子液体破坏了细胞壁和纤维素[20],使得挥发油易于释放的同时包覆了丹皮酚，抑制了该成分迁移与释放[21]。

离子液体的加入可破除细胞壁，溶解纤维素，释放活性成分；与活性成分之间存在一定的相互作用力而有利于传质，使后者迁移到溶剂体系中；破坏细胞壁和纤维素，使丹皮酚更好地迁移。但离子液体加到一定量时提取体系黏度增加，反过来会抑制丹皮酚迁移，故其加入量应有限度，具体有待继续研究。

丹皮酚最佳提取工艺是采用回流(煎煮)提取，离子液体[OMIM]Br,离子液体与水比例1∶3,液料比10∶1,提取2次，KPF6除去残留离子液体，提取液萃取剂乙酸乙酯。与传统提取方法比较，离子液体加入量少，易于去除，污染小；丹皮酚提取率高，操作方法简单，易于工业化；得到了水蒸气蒸馏法不能获得的大量挥发油，有利于节约牡丹皮资源。

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