摘要:柠檬苦素具有抗癌、抗肿瘤、抗菌、镇痛消炎等多种生物活性,在食品和药品行业有很大开发前景。基于此,它的提取分离尤为重要,对柠檬苦素的提取及分离纯化进行简单概述,为柠檬苦素的深入研究提供依据。
1、前言
柠檬苦素又称吴茱萸内酯、黄柏内酯,化学分子式为C26H30O8,分子量为470.53[1]。柠檬苦素及其类似物主要富集在柑橘属植物的果实中,特别是在种子中浓度最高,是柑橘类水果呈现苦味的主要原因[2]。目前,柠檬苦素的主要提取方法有溶剂浸提法、超临界CO2流体萃取法、超声波辅助法、双水相体系提取法、水溶助剂提取法、索氏提取法等;分离纯化方法有:大孔吸附树脂法、结晶法、制备型HPLC法、高速逆流色谱法等。
2、柠檬苦素的结构及其性质
柠檬苦素类化合物都是具有呋喃环的三萜类化合物,包括37种柠檬苦素类似物和22种配糖体[3]。形态呈具有苦味的晶体,难溶于水、乙醚,溶于甲醇、乙醇、冰醋酸。柠檬苦素的晶体结构很不稳定,一般在加工过程中可能会直接造成它的结构活性变化及功能失活。主要的影响因素有光照、温度及pH值等,在强酸或强碱的存在下,柠檬苦素类似物的糖苷很容易被水解形成相应的糖和苷元,当pH值在5~7时,柠檬苦素相对稳定,当pH值大于10时就柠檬苦素分解成为柠檬酸;在温度45℃~80℃时,柠檬苦素降解的速率随着温度的升高依次升高,温度80℃时的降解速率比45℃时高大约1.5倍[4]。
3、提取方法
3.1 溶剂浸提法
该制备方法工作原理主要是根据被提取物的成分在不同溶剂中的溶解度不同,选用对有效成分溶解度大,对杂质成分溶解程度小的一种溶剂,从而将有效成分从各种植物组织中溶解出来。该提取方法操作简单,提取利用率相对较高,成本低。
张贝等[3]利用90%乙醇的从柠檬皮中提取柠檬苦素,在料液比为1∶40(g/mL)、提取温度稳定为60℃、浸提120min的条件下,提取的柠檬苦素含量最高可直接达到47.555mg/g。高山等[5]利用乙醇作为提取剂从新鲜柚子皮中提取柠檬苦素,最佳提取工艺参数为提取温度50℃,料液比1∶20,浸提的时间80min。刘亮等[6]通过单因素试验和正交试验从枳实的副产物中提取出柠檬苦素,最佳提取工艺参数为乙醇浓度78%、pH值为6.5、料液比1∶6(w/v)、浸提温度60℃、提取时间2h,该工艺条件下柠檬苦素的平均提取率为94.2%。刘晓政等[7]用乙醇作为提取溶剂,在温度为50℃、提取时间60min、料液比l∶20(g/mL)时,得到柠檬苦素的最佳提取工艺条件,得率大约为2.97mg/g。
3.2 超声波提取法
超声波提取的方法主要是通过选用超声波作为辅助植物溶剂快速进行提取,声波产生高速、强烈的空化效应和强烈的搅拌力,破坏植物的内部细胞,使辅助溶剂快速渗透到植物内部细胞中,缩短柠檬苦素的提取时间,提高提取率。该提取方法操作简捷,耗时短,提取率相对较高。
张朝晖等[8]从多种柑橘中用超声波方法提取柠檬苦素,结果表明最佳提取条件参数为:料液比1∶7,提取温度50℃,超声波提取处理所需时间30min,提取溶剂为80%的乙醇:选择80目的样品超声提取最合适;黎继烈等[9]研究金橘的柠檬苦素提取制备,以金橘为主要原料,采用二次回归法通用旋转组合的试验工艺设计,利用超声波辅助提取金橘中柠檬苦素,结果表明最佳提取条件时间为20min,功率为440w,浸提处理温度为60℃,液体原料比30∶1,浸提60min,最终柠檬苦素获得率达(3.6±0.03)%,rsd=0.86%(n=5)。
试验中所需要选择的参试因子对超声波辅助萃取金橘柠檬苦素效率系数影响显著,其主要影响系数次序为超声波辅助处理时间>超声波辅助处理功率>浸提处理温度>液体原料百分比。尤文挺等[10]研究优化了从高橙皮中提取柠檬苦素的超声提取工艺,方法主要在单正交因素线性试验的理论基础上,以声强、乙醇体积的百分数、液体原料百分比、提取持续时间等作为工艺影响评价因素,柠檬苦素超声提取率为工艺评价主要指标,结果最佳提取条件为声强0.2556w/cm2,乙醇体积平均分数70%,料液比30∶1,提取所需时间30min,柠檬苦素乙醇提取率平均为60.90mg/100g。张学娟等[11]为了研究提取橘核中柠檬苦素,试验方法采用四重要因素三稳定水平的正交超声试验方法设计,并对最佳超声提取技术工艺进行稳定性试验,用3种提取方法进行比较6种不同的生产地区的橘核中柠檬苦素的含量。试验结果表明:乙醇浓度为75%、液体原料比为20∶1、提取持续时间为30min、超声提取功率范围为500w,提取工艺效果最好,且稳定可行;与索氏法、回流提取法进行比较,超声辅助提取法能明显提高各种橘核中柠檬苦素的含量,说明此最佳提取工艺可大大提高柠檬苦素的综合利用率。
3.3 超临界CO2萃取法
超临界CO2流体萃取(SFE)是通过调节压力和温度的变化来影响超临界流体溶解度的萃取方法。在这种超临界状态下,将这种超临界流体与其他待萃取分离的物质进行接触,使其能够有效的把极性温度大小、沸点温度高低和流体分子量平均大小的主要成分依次进行萃取分离出来。该提取方法产物提取率高,无溶剂残留毒性,但生产设备复杂,成本相对较高。
孟鹏[12]利用了超临界CO2萃取优化技术提取出了金柑籽植物中的柠檬苦素,并得出了最佳提取率的优化条件其值为:萃取期间压力控制为33MPa,萃取期间温度控制为50℃,萃取持续时间为2.5h的条件下,柠檬苦素最大提取率大约为3.98g/kg。全晓艳等[13]等通过试验研究得出了超临界CO2萃取柠檬苦素时,最佳工艺参数为:时间3.5h,最佳夹带萃取剂浓度为100%,温度为50℃,最佳同时萃取压力浓度为30MPa,影响因素大小为:时间>夹带剂浓度>温度>压力。杨军等[14]利用超临界二氧化碳萃取技术在桔核植物中提取柠檬苦素,最佳提取工艺为:萃取设备压力为30MPa,萃取设备温度52℃,夹带萃取剂一般用量为1.8mL/g,柠檬苦素最终提取量为12.37mg/g。桔核中的超临界萃取物经简单精制工艺即可直接获得含量≥90%值的柠檬苦素,本生产工艺完全符合利用柠檬苦素作为医药原料的生产工艺要求,具有广泛推广应用研究价值。
3.4 双水相体系提取法
就是当两种聚合物,一种聚合物与另一种亲液性的盐或是两种离散盐(一种具有离散性的盐且另一种是亲液性的盐)在适当的化学浓度或是在一个特定的物理温度下相互地混合在一起时就可以形成了双水相提取系统。但该方法较为繁琐,试剂成本也较高,需开发简便易行的试剂回收方法。
汪建红等[15]利用上层乙醇-硫酸铵双水相提取体系提取脐橙肉表皮中的柠檬苦素,由于双水相体系可以同时溶解脐橙肉表皮中的多种油溶性成分和其他水溶性成分,减少了上层提取体系的料液黏度,再加上双水相提取体系的分相耦合作用下所带来的提取体系上层乙醇浓度的明显增加,保证了其在使用较低浓度乙醇60%的提取情况下可以取得较好的提取效果,甚至可以优于使用超声波辅助乙醇提取时的获得率,最后分析结果表明:上层乙醇体积提取浓度为60%,料液比为1∶20(g/mL),硫酸铵为12g,温度为50℃,时间为4h时,提取率最高。汪开拓等[16]利用双水相体系提取柠檬籽中柠檬素的回归预测模型,在提取工艺时间为90.74min、乙醇提取浓度为59.40%、提取温度为74.22℃、液料比为18.08∶1得出最佳工艺条件,在此条件下柠檬苦素得率为12.126mg/g。
3.5 水溶助剂提取法
水溶助剂是一种两亲性有机物质,具有一个烷基链或一个烷基链与强极性/离子基相连的芳香环。为了从生物基质中快速提取生物活性物质,水溶助剂中的溶液必须进入细胞的生物纤维层中以进行提取。
孙小雯等[17]使用水溶助剂异丙苯磺酸钠从枳雀内表层果皮提取柠檬苦素,最佳工艺用量参数为异丙苯磺酸钠的用量是27.7mol,异丙苯磺酸钠溶液浓度是2.3mol/L,浸提持续时间7.0小时,从枳雀内表层果皮局部提取到4.32mg/g的柠檬苦素。曾育聪等[18]研究使用水溶助剂水杨酸钠从陈皮柑橘籽中提取柠檬苦素类物质,结果表明最优提取率的条件为:提取时间5.6h,温度51.8℃,料液比1∶8,水杨酸钠提取浓度为2mol/L,此提取条件下的提取率为5.19mg/g。刘君[19]通过正交提取实验可以得出水溶助剂Na-CuS来提取柑桔树的种子中的柠檬苦素,结果表明最佳提取工艺因素参数为:提取剂浓度为2.5mol/L、提取温度为40℃、提取时间为6h、提取剂用量为25mL,影响因素的主次关系为:提取剂浓度大小>提取剂用量多少>提取温度条件>提取作用时间,在此最佳提取工艺下使其提取率大约为4.322mg/g。
3.6 索氏提取法
索氏提取法,又称连续提取法、索氏抽提法,是从固体物质中直接萃取化合物的一种提取方法。该处理方法操作复杂,耗时长。
张早明等[20]使用索氏提取法对安江香柚籽中的柠檬苦素进行提取,通过实验分析得出最佳提取率的条件分别为:乙醇浓度为90%、提取持续时间2.2h、液料比为40∶1(mL/g),得到这种柠檬苦素的最大提取率是11.36mg/g,通过上述实验结果证实了该提取工艺十分具有稳定性和可行性。罗水忠等[21]从柑橘籽中提取柠檬苦素,索氏提取液为丙酮,对于柑橘籽浸提液进行索氏提取工艺条件的分析优化,最佳提取条件:利用丙酮在80℃高温条件下,索氏连续提取8h。
4、分离纯化
4.1 大孔树脂吸附法
大孔吸附树脂法是一种具有三维结构的多孔树脂吸附剂,它的主要特点是舒适性和稳定性都好,可再生重复回收利用,节约开支;生产工艺简单,操作方便,费用低;适用范围广泛且受外界环境条件变化影响小,对天然产物的分离和提取,吸附树脂进行分离,水煮液直接注入上柱,不用高温浓缩,吸附处理完毕时然后用少量稀醇进行洗脱,洗脱液经高温浓缩、干燥后,即可得到了纯度高、不易于吸潮的产品。
庞立等[22]以柑橘为主要原料深入研究大孔树脂分离处理纯化柠檬苦素,研究结果表明,最佳工艺制备条件分别为:上样的流速1mL/min、上样质量的浓度0.5mg/mL、用pH为6.80%的乙醇溶液作为洗脱剂、洗脱剂的流速为2mL/min,其中吸附的效率是88.53%,解吸附效率是93.47%,得率是82.75%。利用高效液相色谱法检测结果可知,柠檬苦素的含量已经达到了92.79%。杨秋明等[23]从柚皮中进行分离纯化柠檬苦素,得出最优的一次吸附纯化条件为:树脂添加量3.0%(质量分数),25℃在此恒温温度条件下电动摇床以180r/min进行振荡90min,在这个条件下吸附效率都可以达到100%,吸附完全后需要再一次动态分离洗脱,洗脱液再通过化学萃取和重结晶可有效分离纯化柠檬苦素类似物,柠檬苦素纯度可达90.9%。
4.2 结晶法
结晶法是一种较早且应用广泛的分离纯化技术。由于操作简单,对各种分离纯化设备要求低,适用于工业生产,其工作原理是将分离过程中的有效成分或某些杂质达到过饱和状态,然后分析出晶体,从而得到一种高效的分离纯化技术。邹连生[24]采用简单结晶法和分步结晶法从柑桔种子中分离纯化柠檬苦素及其化合物。结果显示,分步结晶法提取的柠檬苦素的回收率比简单结晶法提高了13%,表明分步结晶法提取的柠檬苦素类似物的的率更高。
4.3 制备型HPLC法
制备型HPLC是一种高效的分离纯化方法。在制备型高效液相色谱研究之前,进行了分析型高效液相色谱的各种合成实验,优化分析方法的应用,并将其应用于制备型高效液相色谱中[25]。BRADDOCKRJ等[26]采用活性炭法和高效液相色谱法对葡萄柚种子和伏令夏橙中的LG进行脱色纯化。结果表明,高效液相色谱法造成的损失远远小于活性炭脱色,用活性炭脱色会造成10%-20%损失,而使用制备型HPLC分离纯纯化LG可以将损失降到最低,纯化率可达>95%。
4.4 高速逆流色谱法(HSCCC)
高速逆流色谱法(HSCCC)是由美国Yoichiro博士于1982年开发的一种新型连续、高效的色谱分离纯化技术。在天然植物有效成分的分离纯化方面得到了广泛的关注和应用[25]。向羽[27]采用HSCCC技术,对柚类果实中的柠檬苦素类化合物进行了分离纯化,最佳工艺条件为:正己烷-正丁醇-水的比例为2∶1.3∶1.3,上相流速为20mL/min,仪器转速为1000rpm,下相流速为22mL/min。采用高速逆流色谱(HSCCC)对样品进行分离纯化。该产品纯度高,对试剂和载体无污染,试剂消耗低,样品组分分离度高,可以从极其复杂的样品中分离特定组分。
5、结语
柠檬苦素本身具有的生物活性对人类有很大的作用,在生物制剂及食品药品方面都有较为广阔的发展前景,所以柠檬苦素的提取、分离纯化、检测工艺研究尤为重要。随着科研人员努力不断地研究发明,柠檬苦素的提取、分离纯化、检测工艺技术得到了层层升级优化,选用最具有经济、高效、合理的方法,充分提高柠檬苦素的提取率,为柠檬苦素的进一步开发利用奠定了重要基础。
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文章来源:赖庆茹,杨锦棉,何沁儒,李清泉,郑培君.柠檬苦素的提取工艺研究进展[J].轻工科技,2021,37(11):4-6.
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