巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，功能补肾阳、强筋骨、祛风湿[1]。巴戟天含有糖类、蒽醌类、环烯醚萜类、黄酮类、氨基酸及微量元素等化学成分[2]。巴戟天含糖量达10%～25%,包括单糖、低聚糖类及多糖类化合物，如耐斯糖、菊淀粉系列的六聚糖和七聚糖等；另外还含有丰富的果糖和蔗糖及一些多糖类化合物[2]。巴戟天糖类测定方法有高效液相色谱法[1]、苯酚-硫酸法[3]、色谱-蒸发光散射检测器联用法[4]。巴戟天糖类具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗抑郁等作用。巴戟天寡糖具有促血管生成的活性[5]、增强免疫功能[6]、抗抑郁[7]、促进雄性小鼠精子生成、保护生殖系统等作用，与中医学中“补肾阳”的功效一致[8];其可通过防止钙超载来预防大鼠心肌缺血进而造成灌注损伤[9];并能明显保护子宫缺血再灌注损伤[10]。巴戟天多糖具有抗氧化、抗疲劳、免疫调节、抗骨质疏松等多种生物活性[11]。因此，本研究选用糖类作为巴戟天的质量标志物。

巴戟天的炮制方法有净制、切制、药汁制、盐制等，《中华人民共和国药典·一部》[1]及《中药炮制学》[12]等收载了生巴戟天、巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天。书中记载盐巴戟天：“取净巴戟天，照盐蒸法(通则0213)蒸透，趁热除去木心，切段，干燥。”但盐巴戟天生产中的具体工艺参数并不明确，各饮片厂生产工艺参数都是根据本厂经验进行盐巴戟天的生产，为此笔者以盐蒸巴戟天色泽、质、味等方面的性状评分和巴戟天多糖、还原糖、总糖含量为指标，采用拉丁方试验对盐巴戟天工艺参数进行了优选。现报告如下。

1、材料与仪器

1.1 材料

葡萄糖对照品(天津市大茂化学试剂厂，批号：20180606);食盐(雪天盐业集团股份有限公司广东分公司，批号：20191115);苯酚、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、硫酸、乙醇等均为分析纯，水为去离子水。3批巴戟天饮片来源信息见表1。经南方医科大学中药鉴定教研室刘传明副教授鉴定均为为茜草科植物巴戟天orinda officinalis How的干燥根。

表1 3批巴戟天饮片来源

1.2 试液配制

苯酚溶液：精密称取6.0 g苯酚，用蒸馏水溶解并定容于100 ml量瓶中。二硝基水杨酸(DNS)试液：取0.65 g的DNS溶于适量蒸馏水中，再加入32.5 ml 2 mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液，再加入4.5 g丙三醇，用蒸馏水定容于100 ml。

1.3 仪器

UV-2600型紫外-可见分光光度计可见紫外分光光度仪(日本Shimadzu公司);T-500电子天平[美国双杰兄弟(集团)有限公司];MSX(SD EE)电子分析天平，(Sartorius Lab Instruments GmbH&Co.KG);HH-2数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司);entrifuge 5804R型离心机(德国Eppendorf公司);800Y高速多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司);101-3AB电热鼓风干燥器(天津市泰斯特仪器有限公司);KH-100 dE型数控超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司)。

2、方法与结果

2.1 巴戟天多糖含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

取经105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖约10 mg, 精密称定，置50 ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，配成0.2001 mg/ml的溶液，备用。

2.1.2 巴戟天多糖供试品溶液的制备

取巴戟天饮片，粉碎，过三号筛，得巴戟天粉末备用。取巴戟天粉末约0.2 g, 精密称定，置圆底烧瓶中，加入80%乙醇60 ml并于90℃水浴回流提取1 h, 滤过，滤液备用。滤渣分别用80%热乙醇洗涤3次后连同滤纸再加150 ml纯化水90℃水浴回流提取1 h, 滤过，滤渣分别用热纯化水洗涤4次，合并滤液，转入200 ml量瓶中，加水稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 检测波长的选取

精密量取对照品溶液、巴戟天多糖供试品溶液各1.0 ml, 分别置于50 ml量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液1.0 ml置具塞试管中，加入6%苯酚溶液1.0 ml, 再快速加入浓硫酸5.0 ml, 摇匀，静置5 min后于沸水浴上加热15 min, 取出流水速冷至室温；以试剂作为空白对照，于400～650 nm波长处测定吸光度。结果显示巴戟天多糖在490 nm处有最大吸收，因此选择490 nm作为巴戟天多糖的检测波长。(见图1)

图1 多糖检测波长选择可见扫描图  

2.1.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 ml, 分别置于50 ml量瓶中，按照“2.1.3”中的方法操作，以0 ml作为空白对照，于490 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线和样品浓度，计算含量，绘制回归曲线，确定线性范围，得到标准曲线Y=10.79X-0.006,RSD=0.9991。(见图2)

图2 多糖测定标准曲线图   

2.1.5 精密度试验

精密吸取巴戟天多糖供试品溶液1 ml, 按照“2.1.3”中的方法操作，于490 nm波长处，连续测定吸光度6次，测定吸光度，计算出RSD=0.69%。

2.1.6 重复性试验

取巴戟天粉末6份，各约0.2 g, 精密称定，按照“2.1.2”中的方法制备巴戟天多糖供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 ml, 按照“2.1.3”中的方法操作，于490 nm波长处测定吸光度，计算出RSD=3.00%。

2.1.7 稳定性试验

取供试品溶液，按照“2.1.3”中的方法操作，于490 nm波长处，在0、15、30、45、60 min时测定其吸光度，计算出RSD=2.39%。

2.1.8 加样回收试验

取已知巴戟天多糖含量样品6份，于水浴回流前加入葡萄糖对照品溶液1.0 ml, 即加入0.2001 mg, 照“2.1.3”中的方法操作，于490 nm波长处测定吸光度，计算加样回收率，结果显示加样回收率为95%～105%,平均加样回收率为98.39%。

2.1.9 巴戟天多糖的测定

取3批巴戟天饮片，分别照巴戟天多糖供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取3个批次的巴戟天供试品溶液各1.0 ml, 按照“2.1.3”中的方法测定3批次巴戟天饮片多糖含量。

2.2 巴戟天还原糖含量测定

2.2.1 巴戟天还原糖供试品溶液的制备

取预处理巴戟天粉末0.4 g, 置于圆底烧瓶中，加60 ml的80%乙醇，水浴加热回流1 h, 趁热过滤，用80%乙醇洗涤残渣和烧瓶3次，每次4 ml, 将滤液与洗液合并，转移至100 ml量瓶中，加80%乙醇至刻度，摇匀，作为巴戟天还原糖供试品溶液。

2.2.2 还原糖检测波长的选择

分别精密取葡萄糖对照品溶液、巴戟天还原糖供试品溶液2.0 ml, 混匀后加入DNS试液5.0 ml, 沸水浴加热5 min, 冰水冷却后至室温后定容至10 ml。以试剂为空白，于400～650 nm波长处测定吸光度，结合相关文献，发现DNS法检测还原糖选择520 nm为检测波长最适宜。(见图3)

图3 还原糖检测波长选择可见扫描图   

2.2.3 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”中的对照品溶液0、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8 ml分别置于试管中，各加入蒸馏水至2.0 ml, 按照“2.2.2”中的方法操作，以0 为空白，于520 nm波长处测定吸光度，绘制回归曲线，考察线性关系，得到标准曲线Y=57.65X-0.011,RSD=0.9996。(见图4)

图4 还原糖测定标准曲线图   

2.2.4 精密度试验

精密吸取巴戟天还原糖供试品溶液2.0 ml, 按照“2.2.2”中的方法操作，于520 nm波长处连续测定吸光度6次，测定出吸光度RSD=0.35%。

2.2.5 重复性试验

取样品粉末6份，各约0.4 g, 精密称定，按照“2.2.2”中的方法操作，于520 nm波长处测定吸光度，计算RSD为3.10%。

2.2.6 稳定性试验

取巴戟天还原糖供试品溶液，按照“2.2.2”中的方法操作，于520 nm波长处，在15、30、45、60、90、120 min测定其吸光度，计算出RSD=2.85%。

2.2.7 加样回收试验

取已知巴戟天还原糖样品6份，加入葡萄糖对照品溶液2.0 ml, 按照“2.2.2”中的方法操作，于520 nm波长处测定吸光度，结果显示加样回收率为95%～105%,平均加样回收率为98.85%。

2.2.8 巴戟天还原糖的测定

取3个批次的巴戟天饮片，分别按照巴戟天还原糖供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取3个批次的巴戟天样品溶液各2.0 ml, 按照“2.2.2”中的方法测定3个批次巴戟天饮片还原糖含量，根据多糖含量与还原糖含量之和计算出3个批次巴戟天生品总糖。(见表2)

表2 样品含量检测结果

2.3 拉丁方优选巴戟天盐蒸工艺

2.3.1 拉丁方设计因素水平

采用5×5的拉丁方设计对巴戟天盐蒸进行优选，以盐蒸巴戟天色泽、质、味等方面的性状评分和多糖、还原糖、总糖含量为指标，对巴戟天盐蒸的加盐量、蒸制时间、闷润时间等工艺参数进行优化，以蒸制时间为关注因素，其他两者为非关注因素[13]。(见表3)

表3 拉丁方因素水平表  

2.3.2 拉丁方设计试验

分别称取同一批次生巴戟天100 g, 按拉丁方试验设计表，以加盐量、闷润时间、蒸制时间为变量，将盐加适量水溶解，加入巴戟天中拌匀闷润，进行盐蒸，照《中华人民共和国药典·一部》[1]盐蒸法蒸透，趁热除去木心，切段，干燥。对所得盐巴戟天进行性状评价和多糖、还原糖、总糖的含量测定。结果表明，由上述数据分析可得，巴戟天最佳炮制条件为加盐量3%,闷润时间4 h, 蒸制时间9 h。

2.3.2.1 盐巴戟天的性状评价与含量测定

盐巴戟天外观性状评分标准参照《中华人民共和国药典·一部》[1]中关于盐巴戟天的性状及有关文献进行评分[13](见表4)。盐巴戟天多糖、还原糖、总糖的含量测定分别按照“2.1”“2.2”中的方法进行测定。(见表5)

表4 盐巴戟天性状评分标准 导出到EXCEL

内容 A(0%～30%) B(30%～70%) C(70%～100%)

色泽(表面灰黄色或暗灰色，具纵纹和横裂纹。切面紫色或淡紫色，中空。满分40分)表面颜色、切面颜色及纹理3种指标均不达要求表面颜色、切面颜色及纹理3种指标中有1～2项符合要求表面颜色、切面颜色及纹理3种指标均达标

质(切面皮部厚，满分25分)切面皮部薄 切面皮部厚度中等 切面皮部厚

味(气微，味甘、咸而微涩，满分35分)味甘、咸而微涩均不符合味甘、咸而微涩中符合1～2项味甘、咸而微涩均符合

表5 拉丁方试验表

2.3.2.2 不同变量对性状的影响

采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析。结果显示，加盐量对总评分的影响最明显，当加盐量为0时总评分最低，当加盐量为3%或4%时评分较高；当蒸制时间为6 h时评分最高，后评分随蒸制时间增长而变低；闷润时间为4 h时评分最高。(见表6、图5)

表6 不同变量对性状的影响

图5 不同变量对总评分的影响   

2.3.2.3 不同变量对多糖含量的影响

采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析。结果显示，蒸制时间的影响最为明显，其次是闷润时间，而加盐量对盐制巴戟天几乎无影响。当蒸制时间为6 h时盐制巴戟天多糖含量达到最高；当加盐量为3%时盐制巴戟天多糖含量达到最高；当闷润时间为3～4 h时盐制巴戟天多糖含量达到最高值。(见表7、图6)

表7 不同变量对多糖含量的影响

图6 不同变量对多糖含量的影响   

2.3.2.4 不同变量对还原糖含量的影响

采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析。结果显示，闷润时间的影响最大，其次是加盐量、蒸制时间。当闷润时间为1 h或4 h时盐制巴戟天还原糖含量达到最高值；当加盐量为1%或4%时盐制巴戟天还原糖含量较高；当蒸制时间为9 h时盐制巴戟天的还原糖含量达到最高值。(见表8、图7)

表8 不同变量对还原糖含量的影响

图7 不同变量对还原糖含量的影响   

2.3.2.5 不同变量对总糖含量的影响

采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析。结果显示，蒸制时间为9 h时盐制巴戟天总糖含量最高；当加盐量为3%时盐制巴戟天总糖含量达到最高值；当闷润时间为4 h时盐制巴戟天总糖含量最高。(见表9、图8)

表9 不同变量对总糖含量的影响

图8 不同变量对总糖含量的影响  

2.4 巴戟天盐蒸对巴戟天糖类成分的影响

分别称取各批次净巴戟天100 g, 按照巴戟天最佳盐蒸工艺参数，依次按照加盐量3%、闷润时间4 h、蒸制时间9 h进行盐蒸，按照盐蒸法(《中华人民共和国药典·一部》[1]蒸透，趁热除去木心，切段，干燥。对所得盐巴戟天按照表4标准进行性状评分，按照“2.1”“2.2”中方法进行盐巴戟天多糖、还原糖的含量测定，并计算总糖含量。结果表明，巴戟天在最佳盐蒸工艺条件下进行盐蒸，所得盐巴戟天性状良好，功效成分含量稳定。巴戟天在盐水蒸之后多糖、还原糖以及总糖含量都有提高。(见表10)

表10 巴戟天盐蒸对巴戟天糖类成分的影响

3、讨论

本研究通过以巴戟天性状和糖类成分为质量标志物，采用拉丁方试验设计优选巴戟天盐蒸工艺，结果显示，最终得到最佳巴戟天盐制方案为加盐量3%、闷润4 h、蒸制9 h。本研究通过对巴戟天盐蒸工艺的优化，为巴戟天盐蒸提供了详尽的工艺参数，可用于盐巴戟天饮片的工业生产。后续饮片厂可根据工厂设备条件，进一步进行系统研究，参照本研究，制定出规范可行的巴戟天工艺流程及工艺参数。

巴戟天性微温，味甘、辛，能补肾阳、强筋骨、祛风湿。现代药理作用表明，巴戟天糖类能够让人体内蛋白受体识别甘味，同时能够促进雄性精子生成，保护生殖系统，促进骨生长，与传统功效“补肾阳，强筋骨”相合，因而采用糖类成分作为巴戟天的质量标志物具有较好的合理性[11,14]。巴戟天糖类成分体现了“甘味”,而“辛味”主要是化学成分为萜类和生物碱类[15]。研究表明巴戟天中的烯醚萜苷类成分是治疗风湿性关节炎的有效成分，能发挥抗炎镇痛的作用[16,17,18]。对巴戟天的质量分析物进行分析，在植物亲缘性及化学特有性中巴戟天属茜草科；对茜草科化学成分及巴戟天属植物亲缘学进行分析，可将环烯醚萜类和蒽醌类化学成分作为巴戟天的质量标志物。因此，后续研究可进一步考察盐蒸对环烯醚萜类和蒽醌类化学成分的影响。

本研究同时考察了盐蒸对于巴戟天多糖、还原糖以及总糖等糖类成分影响，结果表明盐蒸后多糖、还原糖及总糖等糖类成分含量均有不同程度的升高，说明巴戟天通过盐水蒸制后糖类成分发生了较大的变化，多糖和还原糖可能是由苷类成分、大分子糖类成分分解出来，或者从一些组织中释放出来，后续可以进行糖类成分的变化过程研究，进一步明确糖类成分的变化机制。糖类成分是巴戟天重要的成分之一，目前《中华人民共和国药典·一部》[1]中仅标明巴戟天建立了其一种寡糖耐斯糖的质量控制，应将巴戟天其他糖类成分作为巴戟天质量标志物进行巴戟天生品和炮制品的质量控制。

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文章来源:彭静,沈颖,裴子睿等.巴戟天盐蒸工艺研究[J].湖南中医杂志,2024,40(01):140-147.