曼地亚红豆杉(Taxus media Rehd)是由欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)和东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.)天然杂交而成，其主要成分包括紫杉烷类[1]、黄酮类[2]、挥发油类[3]、酚类和甾体类[4]等，具有抗肿瘤[5]、降血糖[6]、抑菌[7]、抗氧化[8]等方面的药理作用。紫杉醇是红豆杉的一种次生代谢产物[9],目前被普遍认为是具有广泛作用和高活性的抗癌药物，但天然的红豆杉属植物中紫杉醇的含量相对较低、且原料来源供应不充分，限制了红豆杉作为主要药用资源的开发和其在临床上的广泛使用。因此，研发新型红豆杉饮片以扩大临床应用是非常必要的。

当前地方各级的炮制规范及药品标准都未收载曼地亚红豆杉，对其现代炮制的研究相对较少，已有研究主要集中在化学成分[10,11,12,13,14]和药理作用方面[15,16,17,18,19,20,21]。黄酒有助于提高化学物质的溶解能力，从而使其更容易被煎煮和提炼。目前还没有研究红豆杉经过酒炙处理后，其紫杉烷类和黄酮类含量的变化及加酒炙的相关参数。因此选取对酒炙曼地亚红豆杉炮制工艺影响较大的因素进行考察，并以紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮的含量为指标，采用熵权法和层次分析法相结合的多指标综合评价方法对曼地亚红豆杉酒炙工艺优化，为曼地亚红豆杉炮制规范化提供参考。

1、仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-16型高效液相色谱仪(日本岛津公司)、KQ-500DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、BSA224S-CW型万分之一电子天平、BT25S型十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)、XSP-2(CA)型生物显微镜(上海普丹光学仪器有限公司)、LX3611马弗炉(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)、仪表恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司)。

1.2 试剂

对照品：紫杉醇(批号：J04S11H123510)、银杏双黄酮(批号：AF22032002)及金松双黄酮(批号：P20N10F103774)均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%;花雕酒(浙江越景绍兴酒有限公司，执行标准：GB/T 13662)购于超市，甲醇、乙腈(色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司),三氟乙酸(分析纯，上海市麦克林生化科技有限公司)、水为超纯水。

1.3 药材

曼地亚红豆杉药材购自平顶山市致元生物科技有限公司，经河南中医药大学张振凌教授鉴定为红豆杉科红豆杉属植物曼地亚红豆杉的干燥细枝及叶。

2、方法与结果

2.1 成分含量测定

2.1.1 色谱条件

以Waters Symmmetry ShieldTM RP18(250.0 mm×4.6 mm, 5 μm)为色谱柱；以乙腈(A)-0.1%三氟乙酸水(B)为流动相，梯度洗脱(0～14 min, 40%～65% A,14～15 min, 65%～68% A,15～30 min, 68%～100% A);体积流量1 mL·min-1;柱温30 ℃;检测波长为232 nm; 进样量为10 μL。对照品、酒炙曼地亚红豆杉样品及生品的色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

取紫杉醇适量，精密称定，加甲醇制备成质量浓度为140.0 mg·L-1的溶液，精密称取银杏双黄酮、金松双黄酮适量加二甲基叶枫配制成质量浓度分别为230.0 mg·L-1、380.0 mg·L-1 的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称定过5号筛的曼地亚红豆杉炮制品1 g, 加入甲醇50 mL超声(功率500 W,频率50 kHz)30 min, 反复两次，合并滤液，水浴挥干，残渣加甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 线性关系考察

精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液稀释成不同浓度溶液后，按2.1.1项下方法进样分析，以各对照品实际进样量为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y),进行线性回归分析，线性范围涵盖了所有样品的含量值范围，见表1。

图1 对照品(A)、酒炙曼地亚红豆杉(B)样品及生品(C)的HPLC色谱图   

表1 各成分线性关系考察结果

2.1.5 精密度实验

精密吸取2.1.2项下的混合对照品溶液，按2.1.1项条件下重复进样6次，计算紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮峰面积RSD值分别为0.29%、1.01%、0.59%,表明精密度良好。

2.1.6 重复性实验

精密称取酒炙曼地亚红豆杉饮片1 g, 共6份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定。计算紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮的质量分数RSD值分别为1.50%、1.43%、1.46%,表明重复性好。

2.1.7 稳定性实验

精密称取酒炙曼地亚红豆杉饮片1 g, 按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件测定，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定。计算紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮质量分数，其RSD值分别为0.99%、0.74%、2.02%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收实验

称定酒炙曼地亚红豆杉供试品约0.5 g, 精密称取，平行6份，分别精密加入紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮混合对照品溶液适量，按照供试品溶液的方法制备，计算紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮回收率分别为101.55%、101.42%、101.83%,RSD分别为1.78%、2.12%、1.97%,表明该方法的准确度良好。

2.2 综合评价指标的确定

2.2.1 确定权重系数(Wj)

本实验以紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮的含量为评价指标，采用1～3标度法构成评价指标两两比较的优先矩阵，计算各指标权重系数(Wj)。其中紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物，课题组前期将指纹图谱与网络药理学结合已被证实为曼地亚红豆杉中的Q-marker, 因此排名第1位，银杏双黄酮和金松双黄酮含量较高，同时银杏双黄酮对高糖诱导的微血管内皮细胞炎症有保护作用[22],金松双黄酮对UGT(尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶)具有一定的抑制作用[23],故将两者并列排于第2位。根据影响酒炙曼地亚红豆杉指标间的相互关系及重要程度，确定各指标先后顺序：紫杉醇>银杏双黄酮=金松双黄酮，结果见表2。

表2 指标成分成对比较优先判断矩阵及权重系数

2.2.2 AHP-熵权法计算复合权重

根据熵权法的原理，计算得到紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮复合权重W依次为0.481 5、0.257 2、0.261 3。

2.2.3 确定综合评估指标

根据公式

(式中，Yj为每次实验紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮3项指标对应的测定值，Yjmax为各成分对应的最大测定值)计算总分(OD),以OD值为最终的评估指数。

2.3 酒炙曼地亚红豆杉炮制工艺的单因素实验

取曼地亚红豆杉饮片50 g, 加黄酒拌匀，闷润，文火炒干。以OD值作为决策目标，初步筛选影响酒炙曼地亚红豆杉饮片的4个因素：加酒量(10%、15%、20%、25%)、炮制温度(70 ℃、100 ℃、130 ℃、160 ℃)、炮制时间(5 min、10 min、15 min、20 min)和闷润时间(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)。采用单因素测试，确定每个因素的优化区间，结果见图2。

2.4 Box-Behnken响应面实验

2.4.1 Box-Behnken响应面实验设计

通过单因素实验结果确定各个因素水平范围为加酒量(A)10%～20%、闷润时间(B)80 min～100 min、炮制时间(C)10 min～20 min、炮制温度(D)90 ℃～110 ℃。以紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮含量的综合评分为评价指标，采用Box-Behnken响应面实验设计，计算OD值。见表3。

图2 加酒量、闷润时间、炒制时间和炒制温度对曼地亚红豆杉OD值的影响   

表3 酒炙曼地亚红豆杉Box-Behnken响应面实验设计及结果

2.4.2 实验结果与响应面分析

方差分析的结果见表4。二次多项式方差为OD=92.07+1.23A+3.03B+2.23C+5.63D-1.92AB+2.51AC-4.13AD-0.56BC-0.45BD+1.31CD-3.35A2-3.90B2-5.55C2。总模拟方程呈极显著性(P<0.000 1),失拟项(F值为2.12,P值为0.244 2>0.05)不显著。根据F值可知，各因素对三项指标的贡献率为D>B>C>A,其中B和D项极显著(P<0.005),C项显著(P<0.01),二次项A2(P<0.01)、B2(P<0.05)、C2(P<0.000 1)、D2(P<0.000 1)均显著。同时交互项AD对工艺影响也有显著性(P<0.05)。绘制的3D效应面图，结果见图3,响应曲面较陡说明两实验因素交互作用显著。

2.4.3 最佳工艺预测

以酒炙曼地亚红豆杉饮片OD值为条件，使用软件拟合得到曼地亚红豆杉最佳酒炙工艺为：每50 g曼地亚红豆杉饮片，加入14.91%的黄酒，闷润时间为93.61 min, 炒制温度为102.89 ℃,炒制时间为16.06 min。

2.5 工艺验证

按最佳条件进行3次验证实验，同样测定紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮含量计算OD值，结果见表5。

表4 回归模型方差分析结果

图3 黄酒用量、闷润时间、炒制时间、炒制温度交互作用对曼地亚红豆杉酒炙工艺OD值响应的响应面   

表5 酒炙曼地亚红豆杉最佳工艺验证

2.6 酒炙曼地亚红豆杉饮片质量标准研究结果

2.6.1 性状鉴别

酒炙曼地亚红豆杉饮片，均为不规则的切片，直径约2 mm, 表面黄褐色，某些可见焦斑，质脆，微具焦香气。

2.6.2 粉末显微特征

黄绿色至黄褐色。叶上、下表皮细胞体表均呈类多角形，其中上表皮细胞无气孔，下表皮细胞壁厚、孔多。草酸钙砂晶分布在薄壁细胞内或嵌在纤维上，颗粒状。树脂道较少、呈红棕色。螺纹管胞常见，极少数为梯纹管胞。纤维成束状或单条散生，呈长梭状分布，壁较厚，有斜点状纹孔，见图4。

图4 酒炙曼地亚红豆杉粉末显微特征图  

2.6.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物测定结果

对10批酒炙曼地亚红豆杉样品的水分、总灰分及酸不溶性灰分按2020年版《中华人民共和国药典》测定法测定，水分的质量分数为5.67%～9.88%,总灰分的质量分数为5.15%～6.84%,酸不溶性灰分的质量分数为0.15%～0.58%。测定10批样品的水溶性浸出物质量分数为34.10%～36.44%,见表6。

2.6.4 紫杉烷类和黄酮类成分的含量测定

按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进行测定，测定10批酒炙曼地亚红豆杉中紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮的含量，见表7。

表6 水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物测定结果

表7 含量测定结果

3、讨论

临方炮制作为中药临床应用中的重要炮制过程，既适应了中医临床用药灵活多样的特点，又发挥了中医辨证施治的特色，增强了中药临床疗效。课题组前期阶段研究了液体辅料黄酒、米醋、生姜汁和蜂蜜等对曼地亚红豆杉中化学成分的影响，并与化学统计方法相结合，得出最佳的炮制方法为酒炙。酒炙法在传统中药炮制方法中被广泛使用，酒分为白酒和黄酒。实验前期对不同浓度的酒进行研究，结果表明，不同类型、不同浓度的酒对曼地亚红豆杉饮片内在质量具有重要影响，综合评分15.0%黄酒组>10.0%黄酒组>52.0%白酒组，说明应选择黄酒为炮制辅料符合传统观念[24],提示选用酒精度较高的黄酒作为加工辅料，酒炙曼地亚红豆杉饮片质量与酒精含量有关。在炮制过程中，炮制的温度和闷润的时间对曼地亚红豆杉饮片有显著影响，炮制温度过高和闷润时间过长均会导致有效成分损失，综合评分下降。酒炙曼地亚红豆杉饮片在受热炮制时，因饮片内外部温度上升，可使饮片迅速氧化，这一氧化过程就是酒炙曼地亚红豆杉饮片本身内外各种理化性质变化，在受热过程中，不断地从外界吸收能量，当吸收到的能量满足其内在各个分子反应所需的活化能后，药材饮片就产生了一系列外在和内在的变化，外在特征是色泽变深，焦香气外溢，内在特征是紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮的含量增加。与生品比较，酒炙后紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮含量分别增加了17.29%、16.78%和73.02%,双黄酮类化合物含量的增加可能与加热及黄酒的浸入导致黄酮类化合物的分解有关[25];紫杉醇含量的升高可能是由于温度在短期内迅速上升，增加其在醇溶液中的溶解度而导致其含量上升[26]。而其他成分含量增减，是否与增强药效或降低毒性有关，其具体作用机制还需要深入研究。

本实验根据单因素实验结果，采用AHP层次分析中的主观赋权法和客观赋权法相结合，以紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮的含量综合评分作为指标，优选曼地亚红豆杉酒炙工艺。观察酒炙曼地亚红豆杉粉末显微特征，并测定了10批酒炙曼地亚红豆杉样品中的水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物以及紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮等主要活性成分，可为曼地亚红豆杉饮片质量标准的制定提供方法与数据借鉴。与2020年版《江苏省中药饮片炮制规范》、2019年版《安徽省中药饮片炮制规范》和2018年版《上海市中药饮片炮制规范》比较，其三者仅将炮制方法定为净制或切制的质控指标，本实验不仅对酒炙曼地亚红豆杉特定工艺参数进行设定，而且制定的质量标准还加入了粉末显微特征、水分、总灰分及酸不溶性灰分等指标，对水溶性浸出物、紫杉醇、银杏双黄酮和金松双黄酮等成分进行测定，从而为其临方炮制品的加工及质量控制打好基础，以便更好地为中医临床服务。

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基金资助:河南中医药大学2021年度科技协同创新专项项目(2023XTCX041);河南中医药大学2022年度研究生科研创新项目(2022KYCX006);河南省药品监督管理局科技计划项目(2020DB224);公益性行业专项—中药炮制技术传承基地建设项目(00104296);

文章来源:宋永真,李雅静,张振凌,等.曼地亚红豆杉酒炙工艺及质量标准研究[J].中医学报,2024,39(05):1068-1075.