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厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的超临界CO2提取工艺优化

2024-05-22 162 上传者：管理员

摘要：目的优化厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的超临界CO2提取工艺。方法在单因素试验基础上，设计四因素三水平L9(34)正交试验，根据极差比较分析，得到最优提取实验条件。结果最佳实验条件为萃取温度50℃,萃取压力35 MPa,萃取时间3 h,料液比10∶14。厚朴酚、厚朴酚平均萃取率分别为1.47%、2.63%,RSD分别为1.42%、1.74%。结论该方法可用于厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的大量提取。

关键词：
厚朴
厚朴酚
和厚朴酚
正交试验
超临界CO2提取工艺
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厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1,2],主产于四川、重庆、湖北和浙江[3]。据《本草纲目》记载，厚朴味苦辛、性温，具有行气化湿、温中止痛、降逆平喘的功效[4,5,6],主要活性成分为木脂素类厚朴酚与和厚朴酚[7,8],两者互为同分异构体。2015年版《中国药典》规定，厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的含量不得少于2.0%[9]。厚朴酚具有较强的抗氧化活性，同时具有抗菌、抑制血小板凝集和抗肿瘤等作用[10,11,12]。和厚朴酚具有抗焦虑活性，同时对肿瘤细胞有很好的疗效，可抑制癌细胞生长，并诱导癌细胞凋亡[13,14,15]。因此，对厚朴中的厚朴酚与和厚朴酚进行提取研究，具有重要的应用前景。

目前，厚朴酚与和厚朴酚的提取方法主要有溶剂浸提法、索氏提取法、超声提取法、微波提取法等[16,17,18,19],但存在提取时间长、提取温度高、厚朴酚与和厚朴酚容易氧化变质、提取效率低等缺点。超临界CO2萃取技术作为一种新型天然产物提取技术，适合含有酚羟基等易氧化、热敏性物质的萃取分离[20,21,22]。本研究采用超临界CO2提取厚朴中的厚朴酚与和厚朴酚，正交试验获得最优提取工艺，为两者提取及进一步深入研究提供参考。

1、材料

1.1 仪器

SFE-650M超临界萃取仪[适安佳(北京)生物科技有限公司];LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);RE-5299旋转蒸发器(上海耀特仪器设备有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵(郑州华辰仪器有限公司);AB135-S电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];BZF-30真空干燥箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);BJ-2500A拜杰多功能粉碎机(浙江德清拜杰电器有限公司)。

1.2 试剂与药物

厚朴(四川省龙森中药业有限公司)经达州中医药职业学院唐荣伟教授鉴定为正品。厚朴酚、和厚朴酚对照品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。甲醇为色谱纯(美国Tedia公司);其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2、方法

2.1 超临界CO2提取

将药材于45 ℃真空干燥箱中恒温干燥24 h, 粉碎，过60目筛，得到细粉，准确称取100 g, 添加少量甲醇作为夹带剂，采用超临界CO2进行萃取，合并提取液，过滤，滤液定容至500 mL,采用HPLC法检测厚朴酚、和厚朴酚的含量，计算提取率。

2.2 色谱条件

InerSustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相甲醇-水(78∶22);体积流量1.0mL/min; 柱温30 ℃;检测波长294 nm; 进样量20 μL。在上述色谱条件下，厚朴酚、和厚朴酚得以完全分离，其保留时间分别为9.5、14.1 min, 见图1。以峰面积外标法进行定量分析，从而得到厚朴中厚朴酚与和厚朴酚含量，计算其提取率。公式为提取率=(C×V)/M×100%,其中，C为提取液中厚朴酚(和厚朴酚)含量，V为萃取液体积，M为药材质量。

图1 各成分HPLC色谱图

2.3 标准曲线

称取厚朴酚、和厚朴酚对照品各0.020 0 g, 加入少量甲醇溶解，定容至100 mL,使两者质量浓度均为0.2 mg/mL,得到贮备液，分别吸取0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,甲醇定容至25 mL,得到不同质量浓度的对照品溶液。以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得厚朴酚方程为Y=3 942.610 2X+8.810 5(r=0.999 9),和厚朴酚方程为Y=4 252.052 7X+4.474 9(r=0.999 8),在0.004～0.080 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4 单因素试验

超临界CO2提取效率主要受温度、压力、时间和料液比的影响，同时原料颗粒大小和夹带剂种类、用量也会产生一定的影响。根据厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的化学结构及其高温容易分解的性能，选择萃取温度、萃取压力、萃取时间和料液比为影响因素，厚朴酚、和厚朴酚萃取率为评价指标，进行单因素试验。

2.5 正交试验

参照单因素试验确定的萃取温度(A)、萃取压力(B)、萃取时间(C)和料液比(D),设计四因素三水平L9(34)正交试验，具体见表1。

表1 因素水平

3、结果

3.1 单因素试验

3.1.1 萃取温度

固定萃取压力30 MPa、萃取时间2.0 h和料液比10∶10,考察不同萃取温度对厚朴酚与和厚朴酚提取率的影响，平行3次，结果见图2。由此可知，厚朴酚与和厚朴酚的提取率均随温度的升高而先增大后减小，当温度为50 ℃时达到最大值，这是因为萃取初期温度越高，分子运动越快，厚朴酚与和厚朴酚迅速从厚朴中分离出来，萃取效率明显增加；但超过50 ℃时CO2密度下降，厚朴酚与和厚朴酚不容易从厚朴中分离出来，萃取效率明显下降。另外，厚朴酚与和厚朴酚属于酚类物质，稳定性较差，在高温下容易氧化成其他化合物，导致两者含量进一步下降，萃取效率降低。因此，选择50 ℃作为厚朴酚与和厚朴酚的最佳萃取温度。

图2 不同温度下萃取率曲线

3.1.2 萃取压力

固定萃取温度50 ℃、萃取时间2.0 h和料液比10∶10,考察不同萃取压力对厚朴酚与和厚朴酚提取率的影响，平行3次，结果见图3。由此可知，厚朴酚与和厚朴酚的萃取率随压力的增大呈上升趋势，在较低压力时两者萃取率增大趋势较小；增大为30 MPa后，萃取率急剧升高；达到35 MPa时，萃取率基本趋于稳定，这是因为CO2密度随压力的增大而增大，对厚朴酚与和厚朴酚的溶解能力也随之增大，当压力低于30 MPa时，CO2以亚临界状态存在，两者溶解能力相对较低，达到35 MPa时，CO2以临界状态存在，两者溶解能力急剧增强；超过35 MPa后，原料由于较大的压力被压实结块，两者难以进一步溶出，其萃取率趋于稳定。因此，选择35 MPa作为厚朴酚与和厚朴酚的最佳萃取压力。

图3 不同压力下萃取率曲线

3.1.3 萃取时间

在固定萃取温度50 ℃、萃取压力35 MPa和料液比10∶10,考察不同萃取时间对厚朴酚与和厚朴酚提取率的影响，平行3次，结果见图4。由此可知，随着萃取时间的延长，厚朴酚与和厚朴酚的提取率都在不断的增大；在2.5 h后，两者萃取率基本趋于稳定，说明基本萃取完全。因此，选择2.5 h作为厚朴酚与和厚朴酚的最佳萃取时间。

图4 不同时间下萃取率曲线

3.1.4 料液比

固定萃取温度50 ℃、萃取压力35 MPa和萃取时间2.5 h, 考察不同料液比对厚朴酚与和厚朴酚提取率的影响，平行3次，结果见图5。由此可知，厚朴酚与和厚朴酚的提取率随着料液比的增加而不断增大；在10∶12后，两者的萃取率基本趋于稳定，说明改性剂的用量不能使萃取率进一步增加。因此，综合考虑萃取率、能耗等因素，选择料液比10∶12作为厚朴酚与和厚朴酚的最佳萃取料液比。

图5 不同料液比下萃取率曲线

3.2 正交试验

参照单因素试验所确定的萃取温度(A)、萃取压力(B)、萃取时间(C)和料液比(D),进行四因素三水平L9(34)正交试验，测定厚朴酚与和厚朴酚的提取率(Y),结果见表2。由此可知，提取和厚朴酚的影响因素顺序为萃取温度>萃取压力>料液比>萃取时间，最佳工艺为萃取温度50 ℃,萃取压力35 MPa, 萃取时间2.0 h, 料液比10∶14;提取厚朴酚的影响因素顺序为萃取温度>料液比>萃取压力>萃取时间，最佳萃取工艺为萃取温度50 ℃,萃取压力35 MPa, 萃取时间3.0 h, 料液比10∶14。由于适当延长萃取时间不会对和厚朴酚萃取率产生较大的负面影响，因此确定最优提取条件为萃取温度50 ℃,萃取压力35 MPa, 萃取时间3.0 h, 料液比10∶14。

3.3 验证试验

在优化工艺条件下进行3次验证，结果见表3。由此可知，和厚朴酚与厚朴酚平均萃取率分别为1.47%和2.63%,RSD分别为1.42%和1.74%,表明该工艺萃取效率较高，重复性较好，可应用于工业上的大量提取。

表2 正交试验设计与结果

表3 验证试验结果(n=3) 导

4、讨论与结论

超临界CO2萃取技术是近年来发展起来的，用于中药材有效成分提取、分离和纯化的一项新技术，与传统的溶剂浸提法相比，具有分离效果好、提取效率高、无污染环境、不破坏提取物结构、不影响提取物活性等特点，尤其适合天然产物中多酚类物质的分离和提取。结果表明，在最佳提取工艺条件下，厚朴酚与和厚朴酚的平均萃取率分别为1.47%和2.63%,RSD分别为1.42%和1.74%,满足2020年版《中国药典》“厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的含量应不少于2.0%”的要求。该方法实现了中药材厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的有效萃取，并获得了满意的提取率，为两者大量提取提供了新方法。

参考文献:

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