姜黄(Curcuma longa)是姜科姜黄属植物姜黄的干燥根茎，原产于印度和印度尼西亚[1]。在我国，姜黄主要分布于四川、福建、广东、广西、云南、西藏等省区。姜黄起初被用做烹饪香料，同时，因其具有明亮的黄色而常作为食用色素使用。姜黄素(Curcumin, Cur)是从姜黄中提取的一种多酚物质，也是姜黄香料中生物活性最强的成分，姜黄及姜黄素被世界卫生组织和联合国粮农组织列为食品添加剂[2]。近几十年来，随着对姜黄素研究的不断深入，其多种药理作用被发现和应用，如抗炎、抗真菌和抗病毒、抗肿瘤、心血管保护作用、抗增殖、降低胆固醇、抗血栓、抗肝毒性、止泻、杀虫、利尿、抗风湿、降压、杀幼虫、杀虫、抗毒、酪氨酸酶抑制等作用，姜黄素不仅有广泛的药理作用，也有很好的安全性，研究证明，姜黄素即使在高剂量下也是安全的[3,4,5,6],可接受的每日摄入限量为2.5 mg/kg体重[7]。姜黄素的分子式为C21H2O6,分子量为68.37 g/mol,其由两个邻甲基化的酚以及一个β-二酮组成。如图1。

图1 Cur结构图  

β-二酮结构具有烯醇—酮互变结构，可以随着环境的pH值变化进行转化。在极性、酸性和中性介质中，酮的形态占主导地位；而在非极性和碱性环境中，存在烯醇形式[8]。并且，姜黄素在碱性溶液中也具有光敏性和不稳定性，但在酸性介质中则相对稳定[9]。因此，姜黄素在食品营养和医学领域能否高质量的应用，适当的提取技术的应用起到关键的作用，合适的提取方法应能够保证目标产物选择性、结构的完整性及稳定性[10]。

世卫组织食品添加剂联合专家委员会的规范规定只允许从天然原料中提取的姜黄素类似物用作食品添加剂[11]。目前，提取姜黄素传统方法有乙醇回流法、酸碱提取法等。这些传统的提取方法耗时长、提取率低、耗费大量有机试剂，也对提取物安全性及环境产生影响。近年来发展了多种新技术来提取姜黄素，如超临界CO2萃取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法等[12,13,14],但这些方法都需要特定的仪器设备，价格昂贵，操作费用大，成本高，不适合工业应用。

酶法提取是利用适当的酶来破坏植物细胞壁，使得活性成分更容易被提取出来的方法，具有产物回收率高、溶剂用量少等优点[15,16]。低共熔溶剂(Deep eutectic solvent, DES)能够有效稳定酶—底物的过渡态，降低反应活化能，使酶表现出较高的催化活性[17,18],可以提高姜黄素的提取率[19]。超声波的能量可以帮助溶剂更快更大程度地渗透到样品中，增加接触表面积[20,21,22],并产生膨胀—压缩，显著提高生物活性分子[23,24]的萃取效率。本研究采用超声、DES辅助酶法提取姜黄素，主要研究了超声、DES与酶对Cur提取的协同效果，以Cur提取率为指标，优选提取工艺条件，并通过响应面法优化提取工艺，以期获得提取效率高、经济节约的姜黄素提取工艺条件。

一、材料与方法

1.实验材料：

姜黄，产自安徽亳州，经绥化学院柴宝丽高级工程师鉴定为正品；姜黄素对照品，中国药品生物制品检定研究院；氯化胆碱(ChCl)、1,4丁二醇(BD)、1,2丙二醇(PG)、丙三醇(GL)、乙二醇(EG)、木糖醇(XYL)、乙酰丙酸(LA)、丙氨酸(Ala)、乳酸(HL)、柠檬酸(CA)、苹果酸(MA)、葡萄糖(Glc)、蔗糖(Suc)均为分析纯，麦克林有限公司；无水乙醇(EtOH),分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；蒸馏水，自制。

纤维素酶(50 U/mg)、半纤维素酶(50 U/mg)、果胶酶(50 U/mg)、α-淀粉酶(50 U/mg)、木聚糖酶(100 U/mg)均购自麦克林有限公司。

2.实验仪器：

752N紫外—可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；FA2204B电子天平，OLABO/欧莱博；TG16-WS高速离心机，上海叶拓科技有限公司；PL-S60T型超声波清洗机，康士洁超声波科技有限公司；FW80高速万能粉碎机，天津泰斯特；HH-S8数显控温恒温水浴锅，常州市亿能实验仪器厂。

3.实验方法：

(1)基本提取方法：①酶法提取部分：将姜黄粉碎成粗粉，称取0.4 g,按照提取物含量20%的比例加入酶，加入pH4.8缓冲溶液5 ml,振摇至充分浸润，于60℃恒温条件下酶解45 min。②溶剂提取部分：酶解结束后，向体系中加入DES(含水量为20%)5 ml,超声(300 W)10 min后，于5000 r/min离心10 min,移取上清液适量，稀释250倍后，过滤，测定。(2)Cur提取率的测定：①检测波长的确定：将Cur对照品配制成5μg/ml的无水乙醇溶液，以无水乙醇为空白，利用紫外—可见分光光度仪在200～800 nm的波长范围内进行全波段扫描，确定Cur的最大吸收波长。②标准曲线的绘制：准确称取Cur对照品适量，用无水乙醇溶解配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的系列标准溶液，测定Cur最大波长处的吸光度值，绘制Cur标准曲线。③Cur提取率的计算：R=C×D×V/W×100%,式中：R为Cur提取率，mg/g; C为测得A值代入标准曲线求得的Cur浓度，g/ml; V为提取液体积，ml; D为稀释倍数；W为姜黄加入量，g。(3)提取方法的选择：照基本提取方法，分别以乙醇提取法(不加酶)、酶法(纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和α-淀粉酶),以DES辅助酶法(以ChCl︰GL=1︰2为溶剂),以Cur提取率为指标，进行提取方法的筛选。(4)DES的筛选：按照基本提取方法，DES种类具体如表1,以Cur提取率为指标，筛选DES种类，并与传统溶剂乙醇进行比较。(5)Cur提取工艺条件优化：①单因素实验：以Cur得提取率为指标，考察酶添加量(酶解时酶占姜黄粉末比例为5%、10%、15%、20%、25%),酶解pH(3.6、4.2、4.8、5.4、6.0)和酶解温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)及各因素随酶解时间的变化。②响应面试验：根据CCD和BBD响应法的特点，考虑到经济性以及试验需求，本文选用BBD响应法进行试验设计。根据单因素试验结果，采用Design-Expert 13.0软件进行响应面试验设计，以酶添加量15%(响应因子A)、pH 4.8(响应因子B)、酶解温度60℃(响应因子C)作为响应面的中心点，具体试验设计见表2。根据BBD响应法原理，运行Design-Expert对试验进行分组，对于三因素的BBD响应试验，试验组共有17组。

二、结果

1.Cur最大吸收波长的确定：

Cur标准溶液吸收光谱如图2,在425 nm处Cur有最大吸收，故选定为检测波长。

2.Cur标准曲线：

利用紫外—可见分光光度法，在425 nm处测定Cur标准溶液吸光度，以浓度(X)对吸光度(Y)作标准曲线，得回归方程为Y=0.1458X+0.0183,R2=0.9994,具体如图3。

3.提取方法的选择：

实验结果如图4,不同提取方法对Cur提取率的影响差异较大，采用DES辅助酶法提取Cur效果明显优于其他两种方法，后续试验选用半纤维素酶继续对提取条件进行优化。

表1 DES的制备

表2响应面试验的因素和水平设计

图2 Cur最大吸收波长的确定

图3 Cur标准曲线 

4.DES种类的筛选：

实验结果如图5,不同种类的DES对Cur提取率的影响差异较大，其中ChCl︰LA(1︰3)的提取效果最好，Cur提取率为51.77 mg/g,其次为ChCl︰LA(1︰2),提取率为46.23 mg/g,两种DES的提取率均超过了其他种类DES的提取率，进一步优化提取条件选择ChCl︰LA(1︰3)作为溶剂。

图4提取方法的选择  

图5 DES种类的选择  

5.单因素试验：

(1)酶添加量随酶解时间的影响：实验结果如图6,在90 min酶解过程中，Cur提取率不断变化，随酶添加量的增大而增大，酶添加量为15%时，各酶解时间平行对比的Cur提取率均较优，故进一步优化提取条件选择酶添加量为15%。(2)酶解pH随酶解时间的影响：酶解pH对Cur提取率随时间变化的影响如图7,酶解时间90 min内，酶解pH在3.6～4.8范围内，Cur的提取率随pH的增大而增大，在pH=4.8时，各时间平行对比的Cur提取率均较优，其中pH=4.8、酶解时间30 min时，Cur提取率达到52.79 mg/g,当pH>4.8时，Cur得率呈现下降趋势，故进一步优化提取条件选择酶解pH为4.8。(3)酶解温度随酶解时间的影响：酶解温度对Cur提取率随时间变化的影响如图8,酶解时间90 min内，在酶解温度为30～60℃时，Cur提取率呈现上升趋势，在50～70℃之间，逐渐达到平衡，60℃时，Cur提取率最高。因此，选择50～70℃进行响应面优化试验。(4)酶解时间的影响：酶添加量受酶解时间的影响在30 min内变化较大，30 min时Cur提取速率快，之后提取率不再增加，但酶添加量为10%和15%较其他添加量条件下的Cur提取率高，可作为继续优化的水平(如图9a)。酶解时间在30 min范围内，各pH条件下Cur提取速率快速增大，原因为样品和酶充分接触后，促进了样品的酶解。但30 min后，pH=3.6、pH=4.2、pH=4.8、pH=5.4趋于平衡，而pH=6.0、30 min后提取率开始下降(如图9b)。90 min内，酶解温度为40℃的Cur提取率不断处于上升状态，说明酶用量过少，与样品粉末接触不充分，对细胞壁的破坏程度也不完全；酶解温度50℃、60℃时，提取可在30 min后达到平衡，但酶解温度60℃的各时间提取率较高；提取温度70℃、80℃,提取率先升后降，60℃酶解温度下各时间点Cur提取率均优于其他温度条件(如图9c)。

图6 Cur提取率随酶添加量的时间变化图 

图7 Cur提取率随酶解pH的时间变化图

图8 Cur提取率随酶解温度的时间变化图

6.响应面试验：

(1)响应面实验设计及结果：本次试验共有17组，5组为响应面中心点的重复试验，可用于校验试验误差，其余12组为析因试验，试验点均匀分布，可以建立相应的回归模型，结果见表3。对试验数据进行处理，进行回归拟合，可得到酶添加量、PH、酶解温度关于Cur提取率的二次回归模型，结果如公式所示：y=-458.54225+6.04835ɑ+134.43417b+4.56498c-0.5925ɑb+0.075ɑc-0.239583bc-0.249420ɑ2-1145278b2-0.036355c2,式中：y-Cur提取率(mg/g);a-酶添加量(%);b-PH;c-酶解温度(℃)。(2)方差分析：检验回归模型的可靠性需要进行方差分析，该模型的方差见表4。模型的P值小于0.01,表明该模型整体表现为极显著；模型的失拟项=0.1459>0.05不显著，说明该模型可靠，可以依据该模型进行数据分析。(3)影响因素交互作用分析：回归模型可以确定Cur提取率与各因素之间的定量关系，为形象直观地展现影响因素交互作用对Cur提取率的影响规律，需要进行响应面交互作用分析。根据回归方程可绘制出响应曲面3D图，在进行绘图时，将剩余的一个因素设定为0水平代入回归方程，得到新的回归方程就是关于其余两个因素交互作用的模型。响应曲面3D图中不同颜色表示不同的数值，颜色越深代表数值越大，响应曲面越凸说明Cur提取率越大。等值线是响应曲面从上至下的投影，等值线越密、形状越接近椭圆，说明因素交互作用时对Cur提取率的影响越显著，等值线图的中心区域对应的Cur提取率最大，可以从等值线图中观察到Cur提取率最大时因素的最佳配比范围。由图10a、c、e可以看出，随着酶添加量、PH、酶解温度的增大，Cur提取率呈现出先增大后减小的趋势，由图10b、d、f可以得到酶添加量为14%～16%、pH为4.8～5.0、酶解温度为60℃时，Cur提取率存在最大值。酶添加量和酶解温度交互作用时的3D图凸起程度最大、等高线最接近椭圆，证明酶添加量和酶解温度交互作用时对Cur提取率影响最为显著，此结果与方差分析结果相照应。利用Design-Expert平台中Optimization-Solutions功能对回归模型进行最优参数预测，预测结果为酶添加量为13.66%、pH为4.8、酶解温度为59.6℃时，相应的Cur提取率55.56 mg/g,经三次平行的验证实验，所得Cur平均提取率为55.16 mg/g,相差0.4 mg/g。

表3响应面试验结果            

表4方差分析表

图9酶解时间对Cur提取率的影响  

图10各因素交互作用响应曲面及等值线  

三、讨论

姜黄素具有很高的药用和食用价值，由于溶解度、稳定性较差，使其在制药行业及食品行业中的应用受到限制，适当的提取技术不仅可以保证目标产物结构的完整性，还能保证其生理活性的稳定性。虽然酶法被用于提高生物活性物质的提取效率，但目前为止，还没有应用超声—低共熔溶剂—酶组合技术从姜黄中提取姜黄素的报道。

1.在提取方法筛选试验中，以DES辅助半纤维素酶提取Cur效果最佳，这可能是由于以EtOH为代表的传统溶剂只能依靠浓度差来完成提取，DES可以通过产生氢键及与目标提取物的静电相互作用达到提取的目的，酶法提取可以破坏姜黄粉末的细胞壁，使Cur更易从细胞中溶出，同时减小传质阻力，从而大大增加提取率和缩短提取时间。

2.Cur提取率与DES的pH值、粘度有关，在DES种类选择试验中，Cur在中性和碱性条件下，易降解成肉桂酸，而在酸性条件下较为稳定，当体系粘度较小、扩散系数和表面张力较大时，有利于Cur的溶解浸出，故Cur提取率显著升高。

3.在提取系统中加入酶，能够破坏姜黄细胞壁，提高细胞通透率，显著提高提取效率。酶添加量对Cur得率的影响随酶解时间的增加而增加，原因为酶浓度增大，细胞膜的通透性增加，传质加快，但酶的浓度过大，会增加提取液粘度，随着酶解时间的延长，反而使提取率下降；由于酶的活性存在一个最佳pH范围，酶解pH越接近半纤维素酶的最适pH,半纤维素酶的活性就越强，但因为Cur在中性和碱性条件下稳定性较差，故酶解环境趋近于中性时，随着酶解时间的延长，姜黄素出现降解；适宜的酶解温度能够加快Cur提取速度，但温度过高酶会逐渐失去活性[28],Cur得率呈现下降趋势，并且，在更高的温度下，酶解持续时间越长，Cur含量下降越快，有研究表明，Cur在高于65℃时会发生降解[29]。

4.低共熔溶剂辅助酶法提取Cur,提取率随提取时间在不同条件下呈现一定规律性，在酶添加量、酶解pH值、酶解温度随时间变化的过程中，提取率均在30 min之后不再增加，原因为酶解时间较少时，由于样品与酶没有充分接触，Cur得率较低，随着时间的延长，酶与姜黄粉末细胞壁充分接触，细胞壁溶解或分解，Cur由固体基质的核心向外渗出，受浓度梯度影响较大，当Cur达到一定程度后，浓度梯度逐渐减小，溶剂扩散减慢，Cur的提取量逐渐达到平衡，同时，Cur受pH值及温度影响较大，在较高pH值或较高温度时，Cur不稳定，易降解。

5.在提取条件优化试验中，选定酶用量、酶解pH、酶解温度3个因素为响应变量，姜黄素提取率为响应值，进行响应面优化试验，根据4中P值的大小可以得到该模型单因素A、B、C均表现为极显著，这与前述单因素试验结果相吻合。回归模型均方R2为0.9929,说明有99.29%的试验结果适用于该回归模型，修正均方R2 adj=9837,二者差值小于0.2,说明两者之间存在一致性，即该回归模型合理。变异系数C.V.表示回归模型的离散型，变异系数大于15%时表明数据离散程度较高，需要重新进行试验，本次试验的变异系数为1.35%<15%,说明本次试验数据的离散程度较低，模型较为可靠。

因素交互作用时，酶添加量和酶解温度、酶添加量和pH、pH和酶解温度均表现为极显著。显著性大小可以代表各因素对Cur提取率的影响大小，可见，因素交互作用对Cur提取率的影响大小为，酶添加量和酶解温度>酶添加量和酶解pH>酶解pH和酶解温度，单因素对Cur提取率的影响大小为：酶解温度>酶添加量>酶解pH,这与单因素试验结果相互验证，表明该模型符合试验结果。由此可见，本试验所建立的二次回归模型合理、有效，可用该模型对Cur提取率进行理论预测。

本研究选用半纤维素酶，其在极性溶剂中可溶，但在非极性溶剂中有沉淀，因此在提取过程中采用适当极性的低共熔溶剂，提取过程为首先通过半纤维素酶水解、降解姜黄植物细胞壁，使细胞中的姜黄素更容易、更快速溶解在酶解液中，姜黄素浓度在较短时间内显著提高，再加入适量ChCl︰LA(1︰3),通过超声辅助提取的空化作用加速姜黄素的在溶剂中的溶解和扩散，三者协同提取，达到优化Cur提取工艺条件的目的。

综上所述，本文提供了一种简单、高效的组合提取法，可以显著提高提取效率，保持目标成份的生理活性，节省提取时间和降低提取成本，在姜黄素提取中具有潜在应用价值。

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基金资助:2024年度黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(YWF10236240138));黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(202010236010);绥化学院药食同源特色产品开发与应用创新团队(SIT05005);

文章来源:柴宝丽,王斌,申钰佳.响应面法优化超声､低共熔溶剂辅助酶法提取姜黄素的工艺研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2024,45(13):1250-1257.