消癥丸是临床上妇科常用中成药，可用于治疗乳腺增生[1]、子宫肌瘤[2]、卵巢囊肿[3]等辨证为气滞血瘀型。肝硬化是由多种病因长期反复损伤导致的弥漫性肝损害，在病理学上主要表现为肝脏胶原的过度沉积[4]，因此，尽管中医理论中肝硬化可分为多种证型，但一般认为“血瘀”是贯穿肝硬化发生发展过程的基本病机[5]。而肝硬化是肝纤维化持续增加的结果，临床上可以通过逆转肝纤维化以达到对肝硬化的治疗。鉴于消癥丸功能主治为疏肝行气、活血化痰、软坚散结，基于中医理论的异病同治理论，本研究拟通过动物实验研究其对肝纤维化小鼠的作用以考察是否可用于肝硬化的治疗。

1、材料

1.1动物

清洁级C57BL/6J小鼠36只，雌雄各半，体质量（20±4)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2021-0002。动物饲养于江西中医药高等专科学校实验动物中心，以普通饲料喂养，自由饮水。动物实验经江西中医药高等专科学校实验动物管理和伦理委员会批准（批准号JXTCMSLA2023K002）。

1.2药品与试剂

消癥丸（批号WB38003，国药准字号Z20100057,0.2 g/丸）由雷允上药业有限公司提供；四氯化碳（批号CTC21-D04）购自江苏梅兰化工有限公司；橄榄油（批号RH349091）、无水乙醇（批号20100701）、二甲苯（批号97-007）、甲醛（批号CTC21-D04）购自国药集团化学试剂上海有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA检测试剂盒（批号66210-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司；白细胞介素-6(interlukin-6,IL-6)ELISA检测试剂盒（批号JM-02446M2）购自上海冠泰生物科技有限公司；Ι型胶原蛋白（type I collagen,Col-Ⅰ）抗体（批号20548-1-AP）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）抗体（批号2029-1-lg）、β-actin抗体（批号bs-1560R）购自英国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号JM-1201M2）、TNF-α抗体（批号SF7926-25）、Smad抗体（批号16837-52-8）、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β）抗体（批号TR-00615）购自碧云天生物技术有限公司。

1.3仪器

RM2035型轮转切片机、HI1220型烤片机、ASP300型自动脱水机、EG1160型石蜡包埋机（德国Leica公司）；Precellys 24 touch型生物样品研磨器（法国Bertin公司）；1658033型垂直电泳和转印系统（美国Bio-Rad公司）；Chemi Scope6100型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

2、方法

2.1造模、分组与给药

小鼠适应性饲养2周后，用随机数字表的方法随机分为对照组、模型组和消癥丸（0.91 g/kg，相当于临床等效剂量）[6]组，每组12只，雌雄各半。除对照组外，其余小鼠ip 15%四氯化碳橄榄油溶液（2m L/kg)[7]，隔天注射1次，3次/周，连续注射6周，对照组ip等体积的橄榄油。造模2周后，给药组ig以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制的消癥丸药液，对照组和模型组ig等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，连续给药4周。

2.2血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6及肝组织SOD、MDA、Hyp水平检测

给药结束后，小鼠ip 3%戊巴比妥钠麻醉（2 m L/kg），腹主静脉采血，4℃静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，取上清，按照试剂盒说明书测定血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-6水平。取血后，小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，按照试剂盒说明书测定肝组织SOD活性及MDA、Hyp水平。

2.3肝组织病理学观察

取各组小鼠肝组织，于10%中性甲醛中固定48 h后，逐级脱水，石蜡包埋，制备4μm厚切片，采用苏木素-伊红（HE）染色观察肝组织损伤情况，天狼猩红染色评估胶原沉积情况。于显微镜下选取5个视野，采用Image-pro 6.1软件分析胶原沉积面积，计算胶原沉积面积比。

2.4 Western blotting测定肝组织Col-Ⅰ、α-SMA、TNF-α、Smad和TGF-β蛋白表达

取各组小鼠肝组织50 mg，加入1 m L组织裂解液，采用均质器分散组织，12 000 r/min离心后提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封闭后，加入一抗（1∶1 000),4℃孵育过夜；洗涤加入二抗，室温孵育2 h后，加入ECL显色液孵育，采用化学发光系统扫描条带。

2.5统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析，并用LSD-t检验进行两两比较。

3、结果

3.1对降低肝纤维化小鼠血清中ALT、AST活性的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性显著升高（P<0.05）；与模型组比较，消癥丸组小鼠血清中ALT和AST活性显著降低（P<0.05）。

3.2对减轻肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响

对照组小鼠肝脏颜色鲜红，质嫩软，表面光滑，边缘锐利；模型组小鼠肝脏质地较硬，色暗红，缘钝，表面粗糙；与模型组比较，消癥丸组小鼠肝脏大小、色泽和质地均有所改善。肝组织的HE染色结果见图1，对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞沿肝索由中央静脉向四周呈放射状排列；模型组小鼠肝小叶正常结构被破坏，肝细胞排列紊乱，可见炎性改变，汇管区可见大量炎性细胞浸润，肝窦狭窄，汇管区增宽；消癥丸组小鼠的肝细胞变性、坏死等病理变化均有不同程度的改善。

表1对小鼠血清中ALT、AST活性的影响(,n=12)

肝组织的天狼猩红染色结果显示，对照组小鼠肝脏仅大血管周围有少量胶原染色；模型组小鼠肝组织胶原纤维沉积，纤维间隔明显形成，部分包绕形成假小叶；消癥丸组小鼠肝组织胶原沉积情况明显减轻（P<0.05，表2）。与对照组比较，模型组小鼠肝组织中Hyp水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，消癥丸组小鼠肝组织中Hyp水平显著降低（P<0.05）。

图1小鼠肝组织病理学变化(×100)

表2各组小鼠肝脏胶原面积的比较(,n=12)

3.3对改善肝纤维化小鼠氧化应激和炎症反应的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中SOD活性明显降低（P<0.05），肝组织MDA及血清中TNF-α、IL-6水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，消癥丸组小鼠肝组织中SOD活性明显升高（P<0.05），肝组织MDA及血清中TNF-α、IL-6水平显著降低（P<0.05），表明消癥丸能够改善肝纤维化小鼠氧化应激和炎症反应。

表3对小鼠肝组织SOD活性、MDA水平及血清中TNF-α、IL-6水平的影响(,n=12)

3.4对肝纤维化小鼠肝组织Col-I、α-SMA、TGF-β、Smad和TNF-α蛋白表达水平的影响

如图2、3和表4所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中Col-I、α-SMA、TNF-α、Smad和TGF-β蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，消癥丸组Col-I、α-SMA、TNF-α、Smad和TGF-β蛋白表达水平显著降低（P<0.05），表明消癥丸能够抑制TGF-β/Smad信号通路，从而改善肝纤维化。

图2小鼠肝组织Col-I和α-SMA蛋白表达(,n=12)

图3小鼠肝组织TNF-α、Smad和TGF-β蛋白表达

表4消癥丸对肝纤维化小鼠肝组织TGF-β、Smad和TNF-α蛋白表达的影响(,n=12)

4、讨论

消癥丸是妇科常用中成药，主治气滞血瘀、痰凝所致的乳腺增生病，临床上除用于乳腺增生病外，还可用于子宫肌瘤、卵巢囊肿的治疗[1-3]，同时，也有学者将该方用于黄褐斑的治疗[8]。消癥丸由柴胡、香附、青皮、川芎、莪术、土鳖虫、浙贝母、当归、白芍、王不留行、制大黄11味中药组成。方中柴胡、香附疏肝解郁，调畅气机；当归、白芍补血活血，养阴柔肝止痛；青皮疏肝破气、活血散结消痞；莪术破血行气消积；川芎行气开郁，活血止痛；王不留行活血通经消肿；制大黄、土鳖虫破血逐瘀，通经活络；浙贝母化痰散结，全方共奏疏肝行气、活血化痰、软坚散结的功效。

肝硬化多归属于中医的“胁痛”“积聚”“肝着”“癥积”“肝积”等疾病范畴。依据肝硬化的疾病特点，结合中医理论，现代中医医家对肝硬化的中医病机进行了梳理归纳。其常见病因病机为湿热瘀毒、正虚邪伏、肝失调达、肝郁脾虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚、痰瘀作祟[9]，但贯穿始终的基本病机为正虚邪盛，邪毒久稽，肝络受损，气滞血瘀[5]。许多名老中医也做了类似的阐述，如著名中医肝病学家关幼波教授提出肝硬化是由于气虚血滞，以致瘀血滞流，着而不去，凝血与痰湿蕴结，阻滞血络则成痞块（肝脾肿大），进而凝缩坚硬，推之不移；若脉道受阻则络脉怒张，青筋暴露，认为气虚血滞是早期肝硬化之本[10]。上海肝病名家姜春华也认为肝硬化以血瘀为先，治疗应以活血化瘀为主，使肝脏血行畅通，瘀血化除，瘀化则血行更畅，血行则瘀无所留，由此而肝气亦得畅通而无所窒碍[11]。国医大师朱良春认为肝硬化的发病机制主要为肝失调达、气滞血瘀所致[12]。由此可见，气滞血瘀在肝硬化发生发展过程中地位重要，在此基础上，确立了活血化瘀的肝硬化基本治疗原则，并以活血化瘀为主的中药复方在临床上广为应用。目前，治疗肝纤维化包括肝硬化的常用中成药扶正化瘀片、安络化纤丸、鳖甲软肝片、肝爽颗粒、大黄蛰虫丸等[5]均含有行气活血化瘀中药。

异病同治是指不同的疾病在进展过程中，表现为相同的病机，从而可以采用相同或相似的方法治疗，是体现中医辨证论治理论的重要内容，是中医临证常用的治疗法则。近年来，基于异病同治的中成药扩大适应证应用同样受到中西医结合临床医师的重视，如宁泌泰胶囊不仅用于湿热蕴结所致淋证，还可以用于慢性前列腺炎、精囊炎、附睾炎、良性前列腺增生、膀胱过度活动症等泌尿生殖系统疾病辨证为湿热下注者[13]。扶正化瘀方是治疗肝纤维化的中成药，近年来发现其在心、肾纤维化方面同样具有很好的应用前景[14-15]。因此，鉴于消癥丸的功能主治与肝硬化病因病机较为契合，本研究拟通过动物实验证实其是否可用于实验性肝硬化的治疗。

本研究结果显示，消癥丸可以改善四氯化碳诱导的小鼠血清肝功能，减轻肝细胞炎症反应和肝组织胶原沉积，降低肝组织Hyp含量。肝组织炎症反应是肝纤维化发生发展的重要促进因素，SOD是肝内较强的抗氧化酶，MDA是氧化损伤产物，TNF-α和IL-6是炎症标志物[16]。本研究发现，消癥丸可以提高模型小鼠肝组织SOD活性，降低MDA含量，降低血清中TNF-α和IL-6水平。TGF-β被认为是一种有效且显著的纤维化细胞因子，在肝纤维化过程中以自分泌和旁分泌方式调节肝星形细胞的功能，而由TGF-β介导的Smad通路是肝纤维化的关键调节因子。本研究发现，与模型组比较，消癥丸组小鼠肝组织中TNF-α、Smad和TGF-β蛋白表达水平显著降低，表明阻断TGF-β/Smad信号传导通路可能为肝纤维化的治疗策略。

综上，本研究通过动物实验证实消癥丸可有效改善四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化，其机制与抑制氧化应激反应有关。提示消癥丸在肝硬化治疗方面有一定的应用前景，可进一步开展相关研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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基金资助:抚州市科技计划项目[抚科协字(2022)4-1];

文章来源:王李俊,李雄英,万军,等.消癥丸对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化治疗作用[J].中草药,2024,55(21):7359-7364.