骨髓是机体主要的造血器官，几乎所有血细胞都在骨髓内形成。感染、免疫、药物、化疗、放疗等因素可对骨髓造血干细胞造成损伤，从而导致骨髓造血功能障碍。临床上，骨髓造血功能障碍包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病、血小板减少症等多种血液系统疾病[1]。骨髓造血功能障碍病程长，目前多采用免疫抑制剂如环孢素药物、雄激素(如司坦唑醇)和造血干细胞移植等，尽管以上化学药物在治疗骨髓造血功能障碍的各种疾病中有较好疗效，但这些化学药物的不良反应限制了临床应用[2]。如粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在治疗再生障碍性贫血中，临床长期使用可导致骨髓增生异常综合征[3]。中医学是中华民族的瑰宝，是人们防治疾病和维护健康的重要手段。中医药治疗骨髓造血功能障碍历史悠久，具有良好优势。中药具有多成分、多靶点的特点，能整体调节机体机能，使机体阴平阳秘。药对是方剂的最小特色单位，是中医临床遣药组方常用的配伍形式，是历代医药学家长期医疗实践并被证明行之有效的药物组合，是遵循中医药基本理论而形成。药对能将复杂问题简单化，可作为揭示方剂配伍规律的简单模型，是目前普遍采用的探讨复杂方剂配伍规律的有效途径，有利于揭示中药发挥药理作用机制[4-5]。临床上经常将当归和黄芪配伍组成药对治疗气血两虚证，本文采用网络药理学方法分析黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍的药效成分、作用靶点及相关机制，通过分子对接技术分析黄芪-当归药对核心成分与靶点的结合活性，从理论上验证黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍的疗效。

1、资料与方法

1.1 一般资料

通过TCMSP、batMan-tcm数据库检索黄芪-当归的活性成分及对应靶点，通过OMIM、GeneCards数据库检索骨髓造血功能障碍相关基因靶点。

1.2 方法

1.2.1 检索中药活性成分及作用靶点

在TCMSP和batMan-tcm数据库分别检索黄芪和当归的化学成分及其对应的靶点，然后通过UniProt数据库获得每个靶点的基因名。

1.2.2 检索骨髓造血功能抑制相关靶点

在OMIM、GeneCards数据库中以“suppressive hematopoiesis of bone marro”作为关键词检索骨髓造血功能障碍相关基因靶点，获得的靶点与黄芪-当归药对组成部分的靶点集合，利用在线韦恩图网站获取公共靶点，并构造韦恩图。应用Cytoscape3.6.0软件构建共有靶点与中药活性成分网络，预测核心有效成分。

1.2.3 构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

使用STRING数据库对公共靶点构建PPI网络，选择物种为“Homo sapiens”,得到的网络通过Cytoscape3.6.0软件进行可视化，按照Betweenness Centrality、Closeness Centrality和Degree参数的中值筛选，构建核心基因PPI网络，预测核心靶点。

1.2.4 核心靶点基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

使用R语言clusterprofiler工具包对核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，所得的结果根据显著性排序，并可视化展示。KEGG前20条通路中包含的靶点和相应的活性成分导入Cytoscape3.6.0软件，构建中药-活性成分-靶标-通路网络。

1.2.5 预测菊花-茶活性成分与潜在靶点结合能力

通过网络药理学结果和骨髓造血功能障碍相关文献查阅结果，筛选目前研究较少的潜在干预信号通道，运用分子对接技术进行预测。通过PDB数据库下载靶点受体蛋白3D结构，利用PyMOL软件(www.pymol.org)对蛋白质进行去水、去磷酸根等操作，然后利用AutoDockTools1.5.6、AutoDock Vina软件进行分子对接。结果以结合自由能的高低作为与化合物结合程度的评价标准，一般化合物分子与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大，对接结果越可靠。

2、结果

2.1 黄芪-当归药对成分靶点的筛选结果

通过TCMSP和batMan-tcm数据库筛选、去重，共得到黄芪活性成分39个、靶点425个，当归活性成分100个、靶点1 179个，黄芪-当归药对化合物、靶点去重后得到有效成分132个、靶点1 326个。

2.2 相关靶点与中药活性成分分析情况

在OMIM、GeneCards数据库中获取骨髓造血功能障碍相关基因靶点386个。利用在线韦恩图工具获取疾病靶点与药对的公共靶点54个。见图1。疾病-靶点-成分-药对网络关联图如图2所示。与疾病相关的活性成分67个。见表1。

图1疾病与黄芪-当归药对的靶点韦恩图

图2疾病-靶点-成分-药对网络关联图

表1黄芪-当归药对活性成分

2.3 PPI网络的构建与核心靶点的筛选情况

在STRING数据库中产生的PPI如图3所示。在PPI网络中按照Betweenness Centrality、Closeness Centrality和Degree 3个参数的中值筛选核心靶点19个。见图4。

图3 PPI网络图

图4核心靶点PPI图

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析结果

GO功能富集分析产生条目1 801条，其中生物过程1 777条，分子功能17条，细胞组成7条，分别取前10条进行可视化展示，结果如图5所示。KEGG通路富集分析产生条目97条，最为显著的是非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease),其后依次是恰加斯病(Chagas disease)、阿米巴病(Amoebiasis)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease)、利什曼病(Leishmaniasis)、白细胞介素(IL)-17信号通路。前20条条目如图6所示，各通路与靶点的关联关系如图7所示。

2.5 中药-成分-靶点-信号通路网络构建情况

中药-成分-靶点-信号通路网络如图8所示。

图5 GO功能富集分析结果

2.6 分子对接情况

根据“疾病-活性成分-靶点”网络分析，结合现有文献研究，选择黄芪-当归药对活性成分1,2-Benzenedicarboxylic Acid、Phenylacetic Acid、P-Ethylphenol、Canavanine、Adenine、Uridine等化学成分，以及FASLG、FAS、CASP3、CASP8、BCL2、MPL、THPO、TPO、VAV1、CBL基因靶点和Fas/FasL、TPO/c-MPL信号通路中FASLG、FAS、CASP3、CASP8、BCL2、MPL、THPO、TPO、VAV1、CBL等蛋白靶点进行结合能力预测。6种活性成分与10个疾病靶点和10个靶点蛋白对接，结果发现黄芪-当归药对的主要化学成分与大部分靶点基因和蛋白有一定的结合活性，其中有些有良好的结合活性，甚至表现出强烈的结合能力。见表2。每组最具强烈结合活性的成分与靶点对接结果见图9。

图6 KEGG通路富集分析

图7 KEGG通路富集与靶点关联图

表2黄芪-当归药对活性成分与关键靶点结合能预测(kcal/mol)

图8中药-成分-靶点-信号通路网络

图9黄芪-当归药对与疾病基因蛋白靶点部分对接结果

3、讨论

本研究通过网络药理学分析可知，黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍的核心活性成分可能是Astragaloside Ⅵ、Uridine、Astragaloside Ⅱ、1,2-Dimethylbenzene等。根据化合物-骨髓造血功能障碍公共靶点构造PPI网络可知，关键靶点有TP53、IL1B/6/10、肿瘤坏死因子(TNF)、FOS、PPARG、IFNG、CD34、NFKB1、TGFB1、INS等重要核心靶点基因。TP53基因位于染色体17p13.1,TP53突变型骨髓增生异常综合征(MDS)患者平均骨髓原始细胞比例较TP53野生型MDS患者高(9%vs.5%,P<0.001),而血小板计数较TP53野生型MDS患者低(47×109/Lvs.70×109/L,P=0.002)[7]。与骨髓增生异常肿瘤伴TP53双等位基因失活患者比较，TP53单位点突变患者全血细胞计数较高，而骨髓原始细胞比例较低(P<0.001)[8]。IL-10直接刺激造血祖细胞，增强其存活和髓系偏向分化。髓样B细胞优先表达IL-10,主要来源于前B细胞[9]。相较于TNF-α水平高的急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)患者，TNF-α水平低的ALL和AML患者具有更高的完全缓解率和无事件生存率[10-12]。c-FOS是激活蛋白-1家族的成员，是IKZF1复合体的一个组成部分，主要负责多发性骨髓瘤(MM)细胞中该复合体的激活功能，可显著增强来那度胺在体外和小鼠MM模型中的抗MM活性[13]。

GO功能富集分析结果显示，核心靶点主要参与的生物过程和分子过程包括：DNA结合转录抑制因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性；生长因子活性；生长因子受体结合；DNA结合转录因子结合；DNA结合转录激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性；RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合；蛋白酶绑定；细胞因子受体结合；细胞因子活性；上皮细胞增殖；RNA聚合酶Ⅱ转录调控复合物等。KEGG通路富集分析结果显示，黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍主要作用通路、基因和蛋白包括：IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Th17细胞分化、TP53基因、IL-1B/6/10、FOS蛋白家族等。研究表明，以上信号通路、基因和蛋白参与骨髓造血功能[7-13]。分子对接结果显示，黄芪-当归药对中Phenylacetic acid、P-Ethylphenol、Adenine等化学成分与FASLG、FAS、CASP3、CASP8、BCL2等基因靶点和Fas/FasL、TPO/c-MPL信号通路中FASLG、CASP8、BCL2、MPL、THPO、CBL等蛋白靶点有一定的结合活性，有些具有良好的结合活性，甚至表现出强烈的结合能力。说明黄芪-当归药对的主要活性成分治疗骨髓造血功能障碍具有更高的药物活性，以及和疾病靶点可能会形成稳定的复合物或结合物。

中医学将骨髓造血功能障碍多归于“血劳”“髓劳”“髓枯”“血枯”等范畴。中医学认为，骨髓造血功能障碍与肾、脾、肝有密切关系。骨髓的生成、生理功能和病理变化，与肾有密切关系。骨髓生化依赖于肾精是否充盈，肾藏精，精能生髓，骨髓居于骨中，肾精充盈，则骨髓生化有源；肾精亏虚，则骨髓生化不足。《素问·痿论》云：“肾主身之骨髓。”脾为后天之本，气血生化之源。《素问·灵兰秘典论》云：“脾胃者，仓禀之官，五味出焉”。肾所藏之肾精，亦需脾所运化水谷精微之气滋养。清代医家陈修园也有相同认知，他在《慎柔五书》中提出：“人之既生，全赖于中宫输精于肾，而后肾得以补益。”因此，只有脾胃健、气血旺，精血生化才有源。机体的脏腑组织需要肝藏之血液进行濡养，并维护其生理功能。《灵枢·本神》云：“肝藏血。”《素问·五脏生成》云：“故人卧血归于肝，肝受血而能视，足受血而能步，掌受血而能握，指受血而能摄。”骨髓造血功能障碍可辨证为气血两虚证。当归，甘、辛、温，归肝、心、脾经具有活血补血之功效；黄芪，甘、微温，归肺、脾经具有补气升阳之功效[14]。黄芪当归配伍，可益气又可补血，从而起到气血双补之功效。

黄芪-当归药对可用于治疗肿瘤、心血管系统、消化系统、泌尿系统、血液系统等疾病引起的贫血，其治疗效果显著[15-19]。黄芪-当归药对可促使肾脏分泌促红细胞生成素(EPO)和促进T淋巴细胞分泌EPO样造血生长因子，刺激红细胞的产生、成熟和释放[20],也可刺激骨髓造血祖细胞，促进骨髓集落细胞生长、红细胞系祖细胞增殖，增强粒系、单核巨噬细胞生长、成熟与释放[21]。黄芪-当归药对治疗贫血作用的机制具有复杂性、多样性，仍是目前研究热点。本研究仅通过相关生物信息技术解释黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍的机制，存在很大的局限性。后续将进一步开展动物实验探讨黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍的作用及机制研究。

综上所述，黄芪-当归药对活性成分可能通过作用于TP53、IL1B/6/10、TNF、FOS等核心靶点和Fas/FasL信号通路、TPO/c-MPL信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路，发挥治疗骨髓造血功能障碍的作用。

参考文献:

[1]陈威,徐希科,吕燕慧,等.当归补血汤化学成分及其促造血功能研究进展[J].海军军医大学学报,2023,44(5):609-615.

[3]林万龙,陈瑶,杨剑辉.重组人粒细胞刺激因子用于乳腺癌化疗后辅助治疗专项点评[J].中国现代应用药学,2018,35(6):900-904.

[4]马天翔,顾志荣,沈丹丹,等.近10年药对配伍机制研究进展[J].中国中医药信息杂志,2019,26(12):132-136.

[5]顾俊菲,刘培,陶伟伟,等.药对配伍策略及其内在机制研究述评[J].中华中医药杂志,2021,36(1):45-49.

[6]顾俊菲,孙若岚,刘夫艳,等.黄芪-莪术配伍对结肠癌原位移植瘤模型小鼠SDF-1/CXCR4/NF-κB信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(21):63-72.

[11]宋晓梅,李化,舒莉萍.急性淋巴细胞白血病患儿细胞因子水平与疾病状态的关系研究[J].国际检验医学杂志,2021,42(15):1816-1820.

[12]文志浩,金依颖,杨莹,等.骨髓肿瘤坏死因子-α水平在成人急性B淋巴细胞白血病预后评估中的作用研究[J].中国生物工程杂志,2023,43(12):86-93.

[14]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2020版)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:340-341.

[15]刘玲素,王树庆.当归补血汤治疗肿瘤相关性贫血(脾肾两虚型)的临床研究及安全评价[J].中华中医药学刊,2024,42(1):96-99.

[16]李亭亭,陈捷,吉恩生等.当归补血汤含药血清对间歇性低氧暴露H9c2心肌细胞损伤的作用及机制[J].中国中药杂志,2023,48(21):5881-5887.

[17]杨飞霞,王玉,夏鹏飞,等.当归补血汤化学成分,药理作用,临床应用的研究进展及质量标志物的预测分析[J].中国中药杂志,2021,46(11):2677-2685.

[20]陈玉春,高依卿,王碧英.加味当归补血汤影响红细胞生成素产生的实验研究[J].中国医药学报,2002,17(5):308-310.

[21]张英华,武桂兰,姜廷良.当归补血汤及其含药血清对小鼠红系造血祖细胞克隆的影响[J].中国实验方剂学杂志,1999,5(4):35-38.

基金资助:国家自然科学基金项目(82360905);甘肃省自然科学基金项目(21JB1RA268);甘肃省定西市科技计划项目(DX2023BZ14);甘肃省教育厅高校教师创新基金项目(2023B-116);

文章来源:马真金,牛淑秀,郭文龙,等.黄芪-当归药对治疗骨髓造血功能障碍的作用及机制研究[J].现代医药卫生,2024,40(21):3629-3636.