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高效液相色谱-二极管阵列检测器同时测定植物甾醇

2024-11-18 167 上传者：管理员

摘要：本文建立了一种高效液相色谱-二极管阵列检测器同时测定青蒿中菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷3种植物甾醇化合物的分析方法。结果表明，该方法的精密度、准确度及线性关系良好（R2>0.9994），检测限为0.55～7.07μg·m L-1，定量限为1.67～21.44μg·m L-1，日内、日间精度的相对标准偏差均小于2.93%，加样回收率为90.03%～104.91%。本文所建立的方法可成功应用于青蒿中菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷的质量控制分析。

关键词：
二极管阵列检测器
植物甾醇
药材产品
青蒿
高效液相色谱
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在许多国家，药材产品被用来预防和治疗各种疾病。这些药材毒性低，顺应性高，作为单一成分，对多种疾病有治疗作用[1]。因此，药材产品越来越受欢迎，且已成为一种流行的保健形式。蒿属是菊科的一个属，有350多种。青蒿广泛分布于中国、朝鲜和日本的荒地和河滩，近年来，对青蒿类植物的研究显示，其具有抗疟、抗病毒、抗肿瘤、解热、抗出血、抗氧化、抗肝炎和抗补体等多种生物活性。对其分离化合物的研究表明，其主要成分中植物甾醇有菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等[2-5]。天然产物含有萜类、类黄酮、生物碱、皂苷、酚等多种化合物。化合物的化学成分因植物来源、地理区域、收获时间甚至储存方法等因素而异。这种可变性可导致药理活性的显著差异[6-10]。因此，建立可靠、准确的天然产品分析质量控制方法是评价天然产品安全性和有效性的必要条件。在许多方法中，高效液相色谱法（HPLC）是一种简单而流行的天然产物分析方法[11,12]，其具有操作简便、适应性强、准确度高等优点，在天然产物的分析中得到了广泛的应用[13]。

本研究建立了一种简便可靠的高效液相色谱-二极管阵列检测器联用（HPLC-DAD）方法，用于同时测定青蒿中菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷3种植物甾醇化合物。

1、实验部分

1.1药品及仪器

青蒿植物样品（A1～A6样品产自广州，A7～A12样品产自其它城市）；菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷标准化合物，Sigma公司；乙腈（色谱级Sigma公司）；三氟乙酸（TFA）、甲醇和二甲基亚砜（DMSO），分析纯，中国达茂化学试剂公司。

R-1005型真空蒸发器（江苏高捷节能装备集团有限公司）；Dionex型高效液相色谱仪（德国Sartorius公司）；Thermo Fisher Scientific型超三级四极杆质谱仪（德国Sartorius公司）。

1.2标准溶液和样品溶液的制备

标准溶液将菜油甾醇（500μg·m L-1）、豆甾醇（620μg·mL-1）和胡萝卜苷（640μg·mL-1）的标准原液分别用2%DMSO在甲醇中配制，4℃以下保存。用甲醇适当稀释原液制备工作标准液，用于建立校准曲线。

样品溶液采用超声提取法，在80%的甲醇条件下提取青蒿样品。用真空蒸发器除去溶剂，将残留物冷冻干燥。将干燥后的样品溶解在5mL 2%DMSO的甲醇溶液中。所有样品溶液经0.45μm膜过滤器过滤后，进行HPLC分析。

1.3高效液相色谱-二极管阵列检测器分析条件

HPLC设备由泵（LPG 3X00）、自动进样器（ACC-3000）、柱式烘箱（TCC-3000SD）和ad-3000(RS）组成。系统控制和数据分析由Dionex Chromelon(TM）色谱数据系统软件（德国Dionex）执行。色谱柱为Shiseido C18(4.6mm id×250mm，孔径5μm）。流动相为0.1%TFA水溶液（a）和ACN(b），流速为1.0mL·min-1，进样量为20μL。采用205、254、280、330nm紫外光谱对各标准化合物进行测定，并通过保留时间和紫外模式对各标准化合物的色谱峰进行鉴定。

1.4液相色谱-质谱分析条件

采用液相色谱-质谱分析法对本文所用HPLC-DAD法分析得到的菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷的峰进行鉴定。具体条件如下：液相色谱-质谱分析采用TSQ量子超三级四极杆质谱仪，配备电喷雾离子源，正离子模式。色谱柱为Shiseido C18(4.6mm id×250mm，孔径为5μm），采用与HPLC-DAD分析相同的洗脱程序。质谱工作条件（正ESI离子源）为：离子喷雾电压4000V，汽化器温度100℃，毛细管温度350℃，鞘气压力60psi，辅助气压力30psi，质谱范围为m/z 250～650。

1.5高效液相色谱法的验证

对线性度、精密度和准确度方面进行验证。将含有3种标记化合物的标准原液用MeOH稀释到一系列合适的浓度，以构建校准曲线。稀释后的标准溶液一式3份进行分析。通过绘制峰面积与分析物浓度的关系，建立了校准曲线，并得到了回归方程。采用相关系数（R2）作为线性度的度量。分别在信噪比为3倍和10倍时测定检测限和定量限（LOQ）值。利用日间和日内变化对所开发方法的精度进行了估计。精度采用相对标准偏差（RSD）（%）进行度量。采用尖峰回收率实验对该方法的准确性进行了评价，将准确量的混合标准溶液加入到样品中，然后分别进行3份不同浓度的分析，计算回收率。

1.6青蒿样品的定量分析

采用所建立的质量控制方法对12份青蒿（A1～A12）样品进行分离，每个样品分3次分析。根据标准化合物的校准曲线计算3种标准化合物的含量。

2、结果与分析

2.1高效液相色谱-二极管阵列检测器条件的优化

为确定最佳分析条件，对色谱柱类型、流动相、洗脱体系、检测波长等参数进行了考察。从分辨率、基线和洗脱时间3个方面对分析条件进行优化。在流动相中加入0.1%水溶TFA，抑制峰尾，改善峰形。由于每种标准化合物的最高检测波长存在差异，因此，优化检测波长为205nm（胡萝卜苷）和254nm（菜油甾醇和豆甾醇），注射量为20μL。各化合物的所有峰均在65min内分离成功。3种标准品的HPLC图谱见图1。

图1 标准化合物混合物（a）和青蒿样品（b）的HPLC图

通过比较保留时间和紫外光谱对各化合物的峰进行鉴定，菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷的保留时间分别为30.61、57.62和60.12min。

2.2标准化合物的鉴别

采用液相色谱-质谱法对HPLC-DAD分析得到的菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷的峰进行鉴定。菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷在正离子模式下的质谱见图2。

图2 菜油甾醇（a）、豆甾醇（b）和胡萝卜苷（c）在正电喷雾电离中的离子片段质谱图

由图2可见，在质谱图上，3种化合物的片段在m/z 424处为菜油甾醇，m/z 413处为豆甾醇，m/z608处为胡萝卜苷，说明HPLC-DAD法可以准确测量菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷3种化合物。

2.3线性方程、检出限和定量限

绘制各标准化合物的标准曲线，计算相对回归系数（R2），验证其线性关系，结果见表1。

表1 3种植物甾醇的回归数据、检出限和定量限

由表1可见，3种标准化合物在较宽的浓度范围内线性关系良好（R2>0.9994）。各标准化合物的检出限和定量限分别为0.55～7.07μg·m L-1和1.67～21.44μg·m L-1，说明本文所建立的HPLC-DAD方法具有良好的灵敏度。

2.4精密度和准确度

通过重复日内、日间实验，对所建立方法的精密度进行了评价。制备了3种不同浓度的混合标准溶液，并采用高效液相色谱法进行了分析。通过在1d内分析每种混合溶液5次来确定日内实验。对于日间实验，相同的混合溶液在连续3d内分析5次。采用相应的标定曲线计算各化合物的检出量，精密度用相对标准偏差（RSD）值表示，结果见表2。

表2 青蒿中3种植物甾醇的日内日间精密度

由表2可见，日内和日间实验的RSD值分别为0.41%～2.85%和0.91%～2.93%。日内测定和日间测定的准确度分别为96.33%～109.57%和97.24～107.24%。

为评价该方法的准确性，对3种标准化合物进行了回收率实验，结果见表3。

表3 青蒿中3种植物甾醇的回收率

由表3可见，所选标准化合物的回收率为90.03%～104.91%,RSD≤2.59%，因此，本文所建立的方法具有较好的精密度和准确度，可用于同时测定青蒿中3种植物甾醇的含量。

2.5青蒿样品定量分析

在优化后的高效液相色谱条件下，对12份青蒿样品中的菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷进行了定量分析。青蒿样品的HPLC-DAD色谱图见图2，具体含量见表4。

由表4可见，菜油甾醇含量在16.74～19.53μg·mg-1之间，是3种化合物中含量最高的。豆甾醇和胡萝卜苷的含量范围分别为3.49～4.74μg·mg-1和2.00～2.40μg·mg-1。A1样品中菜油甾醇含量高于其他样品。A6和A1中分别含有丰富的豆甾醇和胡萝卜苷。

表4 青蒿样品中3种植物甾醇的含量测定

3、结论

本文建立了一种准确可靠的HPLC-DAD同时测定青蒿中3种植物甾醇（菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷）含量的方法。该方法具有良好的线性关系、精密度和回收率，可成功地应用于12份青蒿样品中菜油甾醇、豆甾醇和胡萝卜苷的定量分析。由此建立的方法可为改进其它药材的质量控制提供依据。

参考文献: