外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy, TON)是指因交通事故、打架斗殴等事故导致的视神经及其轴突的直接或间接损伤。在闭合性头颅外伤病例中，TON占0.5%～5.0%。目前，传统的激素冲击治疗和视神经管减压术等疗法未能显著提高患者疗效[1]。TON具有发病急、病情重、致盲率高等特点，给人民健康造成极大威胁，也给社会造成沉重负担。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)功能障碍是TON发病的关键环节，RGC在视网膜内含量少且难以再生。直接外力引起的原发性损伤可能导致视神经损伤甚至截断；继发性损伤由于视神经损伤后视网膜微环境失衡，最终导致RGC凋亡。

黄芪甲苷作为一种从黄芪中提取的有机化合物，不仅是黄芪的主要单体活性成分，也是黄芪发挥药效作用的物质基础。已有研究证实，黄芪甲苷在心血管系统、内分泌系统、神经系统疾病中发挥良好的治疗效果，其作用机制涉及调节炎症、自噬、改善缺血缺氧、修复线粒体功能等方面[2-4]。当RGC受损、轴浆流阻滞时，细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量降低，导致腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated kinase, AMPK)激活。AMPK通过直接磷酸化Unc-51-样激酶1(Unc-51-like kinase 1,ULK1)的丝氨酸位点(317、467、555、574、637和777位),从而促进自噬。此外，AMPK还能通过磷酸化结节性硬化症蛋白(TSC1/2)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR),进而抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)的活性，间接促进自噬[5]。在众多参与自噬的信号通路中，AMPK/mTOR/ULK通路是最重要且研究最为深入的通路之一。本研究将进一步探讨黄芪甲苷发挥视神经保护作用的具体机制，特别是其是否通过调控AMPK/mTOR/ULK信号通路，介导自噬以促进RGC存活。相关机制图详见图1。

1、材料

1.1 动物

SPF级KM孕鼠2只，孕20 d, 体质量约55 g, 购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，合格证号：No.11032424114741958,许可证号：SCXK(京)2024-0001。动物饲养于标准实验室条件下，室温20～22 ℃,湿度40%～70%,光照黑暗循环 12 h/12 h, 自由饮水和进食。本实验由北京中医药大学东方医院生物伦理委员会批准，审批号：No.202007。

1.2 药物与试剂

牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、多聚赖氨酸(德国Sigma-Aldrich公司，货号：A4161、P6407);神经基础培养基(美国ThermoFisher Scientific公司，货号：21103-049);小鼠抗Brn-3a单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号：L0921);黄芪甲苷、谷氨酸钠(美国MedChemExpress公司，货号：HY-N0431、HY-W016145);微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)抗体(英国Abcam公司，货号：ab192890);AMPK、mTOR、ULK1、p-AMPK(T172)、p-mTOR(S2448)、p-ULK1(S757)抗体(美国Cell Signaling Technology公司，货号：2532S、2972S、8054S、50081S、2971S、14202S);GAPDH抗体(美国Affinity Biosciences公司，货号：AF7021);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0010);CCK-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒(中国Servicebio公司，货号：G4103)。

图1 黄芪甲苷对谷氨酸钠损伤RGC的保护作用机制图

1.3 仪器

pH计(上海雷磁公司，型号：PHS-3E);双人单面垂直净化工作台(苏州净化公司，型号：SW-CJ-2D);低速离心机(德国Eppendorf公司，型号：5702R);体视显微镜(中国凤凰光学有限公司，型号：XTL-165-XTWZ);YCP-100型气套式CO2培养箱(四川佐诚科技有限公司，型号：KT-YQSB-90);电热恒温水浴锅(北京三二八科学仪器有限公司，型号：HH.S11-Ni2);酶标板自动读数仪(美国BIO-RAD公司，型号：1681130)。

2、方法

2.1 原代RGC纯化培养

原代纯化小鼠RGC由本课题组根据斯坦福大学发布的冷泉港协议[6]自行培育，且细胞培育密度可达8×106mL-1。取KM乳小鼠，在体视显微镜下剥离视网膜并剔除血管，剪碎视网膜并予以木瓜蛋白酶进行消化。随后用LOW-OVO液和HIGH-OVO液终止消化，再将细胞置入含有抗小鼠Thy1.2(CD90)IgM的阳性筛选板中，进行阳性筛选。最后，将纯化的RGC加入含有RGC培养基的孔板中进行培养。

2.1.1 纯化RGC鉴定

取7只KM乳小鼠视网膜，制备原代RGC。将原代纯化RGC接种于爬片上，贴壁后用4%多聚甲醛固定。加入0.2%TritonX-100使细胞通透，5%BSA室温避光封闭。用5%BSA稀释Brn3a抗体(1：50),加入爬片过夜，次日加入荧光二抗进行孵育。PBS稀释DAPI染色液(1：1 000),室温避光孵育1 h。最后，在爬片上加甘油、抗荧光淬灭剂进行封片，荧光显微镜下拍照。

2.1.2 纯化RGC活力检测

取原代纯化RGC,将细胞悬液与0.4%台盼蓝染料以9：1的体积比例混匀，室温静置3 min。将细胞悬液加入细胞自动计数器中，从而测量活细胞比例。

2.1.3 纯化RGC纯度测定

取5只KM乳小鼠视网膜，制备原代RGC,依次加入乙醇、TritonX-100、BSA,用于固定细胞、细胞透膜和封闭细胞非特异性位点。加入Brn3a抗体(1：50)孵育1 h, 再加入抗兔FITC-IgG抗体，孵育1 h。阴性对照以PBS代替Brn3a抗体，其余处理均一致。流式细胞仪分析细胞悬液，激发光波长为488 nm, FITC通道，测量RGC纯度。

2.2 谷氨酸钠最佳造模浓度筛选

取5只KM乳小鼠视网膜，制备原代RGC。将RGC接种于96孔板，待细胞贴壁培养24 h后，加入不同浓度谷氨酸钠：5、10、20、40 mmol·L-1培养24 h, 每组3个复孔。随后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃避光孵育4 h。采用酶标仪测定450 nm处的光密度(optical density, OD)值，最终确定谷氨酸钠的最佳造模浓度。

2.3 透射电镜检测RGC自噬溶酶体

将RCC分为空白组和谷氨酸钠组(20 mmol·L-1),收集细胞沉淀，加入电镜固定液。1%锇酸避光室温固定2 h, 室温脱水，渗透包埋，包埋板放入60 ℃烤箱聚合 48 h, 取出树脂块备用。超薄切片150目铜网捞片，2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8 min, 2.6%枸橼酸铅溶液避CO2染色8 min, 透射电镜观察RGC内自噬溶酶体数量。

2.4 黄芪甲苷最佳药物浓度筛选

取6只KM乳小鼠视网膜，制备原代RGC。将RGC接种于96孔板，待细胞贴壁培养24 h后，每孔加入20 mmol·L-1谷氨酸钠培养24 h。随后，加入不同浓度黄芪甲苷：25、50、100、200 μmol·L-1培养24 h, 每组3个复孔。加入CCK-8工作液，37 ℃避光孵育4 h。采用酶标仪测定450 nm处每孔OD值，并确定黄芪甲苷的最佳药物浓度。

2.5 流式细胞术检测RGC凋亡情况

取15只KM乳小鼠视网膜，制备原代RGC。将RGC分为对照组、模型组(20 mmol·L-1谷氨酸钠)、低剂量黄芪甲苷组(25 μmol·L-1)、中剂量黄芪甲苷组(50 μmol·L-1)及高剂量黄芪甲苷组(100 μmol·L-1),加入适量不含EDTA的胰酶消化贴壁RGC。收集细胞悬液，离心弃上清，4 ℃预冷PBS重悬细胞，离心2次。去离子水稀释Binding Buffer(1：4),用250 μL结合缓冲液重悬细胞。取100 μL细胞悬液于流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min。上机前5 min加入10 μL碘化丙啶溶液，混匀。上机前在反应管中加入400 μL PBS重悬细胞进行检测。最后，通过FlowJo软件调节补偿与分析数据。

2.6 Western blot法检测AMPK/mTOR/ULK通路相关蛋白表达水平

取20只KM乳小鼠视网膜，制备原代RGC,分组同“2.5”。收集对照组、模型组、高剂量黄芪甲苷组细胞，加入40 μL细胞裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制剂),冰浴裂解细胞沉淀 30 min, 收集上清。采用BCA法测量蛋白质浓度，95 ℃煮5 min, 每孔上样10 μL,随后进行凝胶电泳和转膜，采用含5%脱脂奶粉的TBST对PVDF膜进行封闭。使用含5%BSA的TBST分别稀释LC3-Ⅱ抗体(1：2 000)、p-AMPK抗体(1：1 000)、AMPK抗体(1：1 000)、p-mTOR抗体(1：1 000)、mTOR抗体(1：1 000)、p-ULK抗体(1：1 000)、ULK抗体(1：1 000)、GAPDH抗体(1：10 000),孵育过夜，TBST洗膜3次。使用封闭液稀释HRP标记二抗(1：10 000),室温孵育1 h, TBST洗膜3次，每次10 min。配置ECL化学发光液，采用自动化学发光图像分析系统进行曝光，使用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

2.7 统计学方法

采用SPSS 26.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差

表示。若数据符合正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane′s检验；若不符合正态分布，采用K-W秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 原代纯化RGC检测

Brn3a染色显示：Brn3a激发光为红光，DAPI激发光为蓝光，可见红光与蓝光高度重合，见图2A。RGC细胞活率为93.3%,见图2B。RGC纯度可达95.03%,见图2C。

3.2 谷氨酸钠对RGC存活和自噬的影响

谷氨酸钠损伤RGC的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为20 mmol·L-1(P<0.05),后续实验均选取该浓度，见表1。

透射电镜显示：与空白组比较，谷氨酸钠组RGC同时期的自噬溶酶体数量增加，见图3。

表1 不同浓度谷氨酸钠对RGC存活率的影响

3.3 黄芪甲苷对RGC存活率的影响

与对照组比较，模型组RGC存活率降低；与模型组比较，25、50、100 μmol·L-1黄芪甲苷组RGC存活率升高(P<0.01),其中100 μmol·L-1黄芪甲苷的效果更佳，见表2。

表2 不同浓度黄芪甲苷对RGC存活率的影响

图2 原代纯化RGC鉴定、活力检测及纯度测定

图3 各组RGC自噬溶酶体透射电镜图(×10 000)

3.4 黄芪甲苷对RGC细胞凋亡的影响

流式细胞术显示，与对照组比较，模型组RGC凋亡率升高；与模型组比较，低、中、高剂量黄芪甲苷组RGC凋亡率降低(P<0.001),见图4、表3。其中，高剂量黄芪甲苷组的治疗效果更佳，后续采用该浓度进行干预。

表3 各组RGC凋亡率比较

3.5 黄芪甲苷对RGC中AMPK/mTOR/ULK通路相关蛋白表达的影响

Western blot显示，与对照组比较，模型组RGC的AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、ULK表达水平升高，LC3-Ⅱ表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较，高剂量黄芪甲苷组RGC的AMPK、mTOR、ULK表达水平降低，LC3-Ⅱ、p-AMPK、p-ULK表达水平升高(P<0.05),见图5、表4。

图4 各组RGC凋亡流式图

表4 各组RGC中AMPK/mTOR/ULK通路相关蛋白表达水平比较

图5 各组RGC的LC3-Ⅱ、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK、ULK蛋白条带图

4、讨论

TON的主要临床表现包括视野异常、视力下降、色觉丧失以及传入性瞳孔缺损[7]。针对TON的治疗核心在于挽救存活的RGC,延缓或阻断其凋亡与坏死的进程。在遭受剧烈外伤的急性事件中，除了直接的机械剪切力对视神经的损伤外，对RGC的继发性损伤亦不容忽视，主要涉及细胞稳态破坏、神经兴奋性毒性以及自噬激活等病理过程[8]。目前，如何有效保护受损的RGC已成为研究的焦点。

RGC作为神经系统的终末细胞，缺乏成熟的细胞系。既往的RGC-5细胞系虽模拟了RGC的部分特性，但已被证实并非真正的RGC[9]。因此，培养原代RGC成为开展相关研究的关键。鉴于RGC仅占人类视网膜细胞总数的1%(约120万个),对原代细胞进行纯化以获得高质量RGC至关重要。本研究中，通过Brn3a鉴定发现RGC为贴壁细胞，纯化后的细胞紧密排列、相互支撑，且在生长前期呈现类圆形胞体。谷氨酸钠作为视网膜中主要的兴奋性神经递质，主要由光感受器细胞、双极细胞和RGC释放[10]。谷氨酸钠可对RGC产生神经兴奋性毒性，是研究离体RGC损伤的理想模型，已有多项研究证实谷氨酸钠视神经细胞模型成熟可靠。Lucas等[11]发现，注射谷氨酸钠后视网膜内层细胞显著丢失。Hu等[12]研究表明，在谷氨酸钠兴奋毒性青光眼模型中，RGC轴突中线粒体膜电位去极化明显，线粒体自噬相关蛋白如视蛋白(optineurin)和帕金蛋白(parkin)表达上调，对RGC损伤具有保护作用。本研究中，不同剂量谷氨酸钠均对RGC产生损伤作用，且损伤程度呈剂量依赖性增加。为进一步探索谷氨酸钠对RGC自噬的影响，采用透射电镜观察RGC自噬溶酶体情况。结果显示，模型组RGC自噬溶酶体明显增多，提示细胞自噬激活，有利于溶酶体介导的细胞质蛋白和受损细胞器的回收与降解，进而维持正常的生理功能。与其他细胞器比较，自噬的半衰期约为8 min, 显示出对环境变化迅速而有效的应答能力，而对照组自噬保持在较低水平。

TON属于中医“撞击暴盲”“青盲”范畴。《证治准绳》称之为“触伤真气证”,并阐述其病机为“打动珠中真气，络涩滞而郁遏，精华不得上运，损及瞳神而为内障之急”。中医理论强调“气为人之本”,气血相依，气行则血行。黄芪作为补气类代表药物，王清任在治疗跌打损伤时必重用之以促气旺血行。黄芪含多种有效成分，如黄酮类、皂苷类、黄芪多糖等。目前研究较多的是黄芪甲苷，具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒、提高机体免疫力及改善心脑血管功能等作用[13]。研究表明，黄芪甲苷可提高视锥视蛋白表达水平，抑制光诱发的M视蛋白错定位和S视蛋白缩短，从而恢复视力与视觉敏感度[14]。此外，有研究指出，黄芪甲苷可通过上调糖尿病大鼠miR-128的表达，保护视网膜色素上皮细胞，减少细胞凋亡[15]。本研究中，不同剂量(25、50、100 μmol·L-1)黄芪甲苷对谷氨酸钠损伤RGC均有保护作用，可促进RGC存活并降低细胞凋亡。

大量研究证实，黄芪甲苷在周围神经系统、泌尿系统等多系统疾病中，通过调节细胞自噬过程从而发挥治疗作用[16-17]。黄芪甲苷可下调人眼眶成纤维细胞和GO模型大鼠眼眶内自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、苄氯素1(Beclin-1)以及自噬相关基因5(Atg-5)的表达，降低自噬小体数量，抑制眼眶脂肪积累与胶原沉积[18]。TON包括视神经横断(optic nerve transection, ONT)和视神经挤压(optic nerve compression, ONC),两者均为公认的TON模型。关于自噬在RGC损伤修复中的作用，目前存在一定争议。研究发现，还原Zn2+通过抑制ROS/Nrf2通路介导的自噬，促进RGC存活和视神经损伤后的再生[19]。另有研究显示，成年斑马鱼视神经损伤后，损伤诱导的自噬可延迟轴突再生，表明自噬在TON中的潜在负面作用[20]。但Wei等[21]研究证实，褪黑素在TON后可提高RGC自噬水平，抑制细胞凋亡，发挥视神经保护作用。另有学者通过ONT模型证实，自噬在创伤后RGC中具有细胞保护作用，能提高RGC存活率，揭示了自噬在RGC修复过程中的积极作用[22]。本课题组前期致力于研究黄芪对视神经疾病的保护效应，发现以黄芪为君药的重明益损汤、黄芪提取注射液在临床应用与体内外实验中均显示出积极效果[23-25]。本研究中，高剂量黄芪甲苷可提高自噬蛋白LC3-Ⅱ表达水平，提示黄芪甲苷对RGC的保护作用可能与促进细胞自噬相关。

在众多参与自噬调控的信号通路中，AMPK-mTOR-ULK1/2通路是最重要、研究最广泛的通路之一[26]。AMPK是一种在进化过程中高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，作为“细胞能量感受器”,其活性受到细胞内AMP水平的调控。在生理状态下，AMPK通常处于无活性的去磷酸化状态。当面临葡萄糖耗竭、缺血缺氧、生长因子剥夺及内质网应激等情况时，AMPK被激活[27]。AMPK通过调节mTOR信号传导，参与细胞生长的中心途径，但二者具有相反的生物学功能，前者促进分解代谢，后者促进合成代谢。ULK1是自噬起始阶段的上游激酶和mTORC1的直接底物，其在自噬启动中发挥重要作用。ULK1/2的激活受到mTORC1的负向调控。除mTORC1外，AMPK激活也可磷酸化ULK1,进一步促进自噬的启动。研究表明，中药提取物Pien-Tze-Huang可通过调节AMPK/mTOR/ULK自噬通路，增强自噬并抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)介导的炎症反应[28]。本研究中，黄芪甲苷可上调p-AMPK、p-ULK蛋白表达水平，同时下调p-mTOR蛋白表达水平。由此推测，黄芪甲苷促进RGC存活的机制与上调AMPK/mTOR/ULK自噬信号通路有关，与既往研究结论相一致[29]。

综上所述，黄芪甲苷可发挥对谷氨酸钠损伤RGC的保护作用，可能与调控AMPK/mTOR/ULK信号通路，从而促进自噬有关。本研究为黄芪制剂治疗TON的临床研究提供依据，同时揭示黄芪甲苷在治疗视神经疾病中的应用前景和研究价值。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(81973909);

文章来源:税小丁,尚孟秋,罗钰,等.黄芪甲苷对谷氨酸钠损伤视网膜神经节细胞的保护作用[J].中医学报,2024,39(12):2632-2639.