脂肪干细胞(ASCs)是一类广泛存在于脂肪组 织中的多功能干细胞｡ ASCs 在体外可以向多种细 胞和组织分化,如心肌细胞､平滑肌细胞及脂肪､软 骨､骨和骨骼肌等组织〔1〕 ｡ 除了具有分化潜能, ASCs 还可分泌多种促进血管化的细胞因子,促进血 管内皮细胞增殖和迁移,从而加快新生组织内血管 生成〔2〕 ｡ 由于 ASCs 来源广泛､免疫原性较低､对个 体伤害较小, 目前已经成为再生领域的研究热 点〔2〕 ｡ 干细胞移植后能否迁移到损伤部位并存活, 从而进一步定向分化为足够数量的成熟细胞,是干 细胞治疗成功与否的关键因素也是决定性因素｡ 研 究证实,低氧预处理能够促进干细胞适应恶劣的移 植环境并提高其存活率, 有利于组织修复与重 建〔3〕 ｡ 低氧主要通过增加缺氧诱导因子(HIF)-1α 和丝氨酸/ 苏氨酸激酶( Pim)-1 表达及激活蛋白激 酶 B(AKT)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)1 / 2 提高干细胞的增殖､迁移及再生能力〔4~ 7〕 ｡ 此外,中药的 活性成分也可增强干细胞的生存､增殖及归巢能力｡ 红景天苷(SAL)是从红景天中提取的一种苯乙醇类 化合物｡ 文献报道, SAL 促进骨髓间充质干细胞 ( BMSCs ) 增 殖 及 分 泌 血 管 内 皮 生 长 因 子 (VEGF) 〔8,9〕 ,并动员其归巢〔10〕 ｡ SAL 对干细胞功 能的调节作用可能与低氧预处理类似｡ 本研究探讨 SAL 与低氧预处理对大鼠 rASCs 增殖､迁移及成骨 和成脂分化能力的影响｡

1、材料与方法

1. 1 药品及试剂 SD 大鼠脂肪干细胞和完全培养 基､SD 大鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养 基､SD 大鼠脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基 购自赛业生物科技有限公司;SAL 购自成都普瑞法 科技开发有限公司;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和 4′,6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚 ( DAPI ) 均 购 自 SigmaAldrich;抗 BrdU 抗体和 Alexa Fluor488 标记的抗鼠 IgG 购自 Cell Signaling Technology;免疫荧光封闭液 和抗荧光淬灭封片剂购自上海碧云天生物技术有限 公司;茜素红 S 染色液(0. 2%)和油红 O 染色液(细 胞专用)购自北京索莱宝科技有限公司｡

1. 2 细胞培养与预处理 第三代 rASCs 用完全培 养基培养,当融合度超过 80%时,用 0. 25%含乙二 胺四乙酸(EDTA) 的胰酶消化细胞,离心后重悬于 完全培养基,并接种至 0. 1%明胶包被的 6 孔板中, 接种密度为 1×10 6 个/ ml;细胞置于 37 ℃ ,5% CO2 培养箱中培养｡ 当细胞融合度达到 30%,用 SAL 和 低氧预处理细胞 5 d,预处理的细胞分为 4 组:常氧 (NC)组,21%O2 条件下用含二甲基亚砜(DMSO)的 完全培养基培养;常氧+SAL(NS)组,21%O2 条件下 用含 50 μmol / L SAL 的完全培养基培养;低氧(HC) 组,5%O2 条件下用含 DMSO 的完全培养基培养;低 氧+SAL(HS)组,5%O2 条件下用含 50 μmol / L SAL 的完全培养基培养｡

1. 3 BrdU 掺入实验 各组细胞培养于 13 mm 圆形 盖玻片上,用 10 μmol / L 终浓度的 BrdU 孵育 6 h,然 后用 4% 多聚甲醛固定 30 min｡ 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 清洗 3 次,用 0. 1% TritonX-100 室温下孵育 30 min 透膜｡ 用 1 mol / L 盐酸在冰上孵育 10 min, 用 2 mol / L 盐酸在室温下孵育 10 min 后 37 ℃ 下孵 育 20 min｡ DNA 变性后,用 0. 1 mol / L 硼酸钠缓冲 液(pH8. 4) 在室温下孵育 12 min,然后用含 0. 1% TritonX-100 的 PBS 清洗 3 次｡ 用免疫荧光封闭液 在室温下封闭 1 h,用抗 BrdU 抗体(1 ∶500 稀释)在4 ℃下孵育过夜｡ PBS 清洗 3 次,用 Alexa Fluor488 标记的抗鼠 IgG(1 ∶500 稀释)在 37 ℃ 下孵育 1 h｡ 最后用 DAPI 染色,抗荧光淬灭封片剂封片｡ 用激 光扫描共聚焦显微镜( Leica,TCS SP5 Ⅱ) 观察,用 盲法在 20 倍物镜下计数｡

1. 4 Transwell 细胞迁移实验 采用孔径 8 μm 的 Transwell 小室进行 Transwell 迁移试验｡ 预处理后 的细胞经胰酶消化收集后悬浮于含 0. 5% 胎牛血 清的培养基中｡ 30 000 个 / cm 2 细胞接种于上室, 小室放入含完全培养基的 24 孔细胞培养板中｡ 细胞在 37 ℃ 下孵育 12 h 后,用 PBS 洗涤 2 次,小 室上表面用棉签轻轻去除未迁移的细胞,下表面 用 4%多聚甲醛固定 30 min,超纯水冲洗,0. 1%结 晶紫染色 20 min｡ 迁移到下表面的细胞在倒置显 微镜下观察和拍照｡ 用 Pro Plus6. 0 软件对迁移率 进行分析｡

1. 5 成骨诱导及鉴定 当细胞融合度达到 60% ~ 70%时,小心的将孔内完全培养基吸走,向 6 孔板中 加入 2 ml OriCell SD 大鼠脂肪间质干细胞成骨诱导 分化完全培养基｡ 每隔 3 d 换用新鲜的 OriCell SD 大鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使 用前需预热至 37 ℃ )｡ 诱导 2~4 w 后,视细胞的形 态变化及生长情况,用茜素红进行染色,步骤如下: 移除培养板中培养基,用 PBS 洗 2 次后用 4%多聚 甲醛固定 15 min;弃去固定液,用双蒸水洗 3 次;将 水完全吸干净后慢慢加入茜素红 S 染色液,染色 20~30 min;弃去染料,用双蒸水洗 3 ~ 5 次;每孔加 入适量双蒸水防止孔内干燥,倒置相差显微镜观察, 100 倍视野下计数钙化结节数量｡

1. 6 成脂诱导及鉴定 细胞融合度达到 100%或 者过融合时,小心地将间质干细胞完全培养基吸走, 向 6 孔板中加入 2 ml OriCell SD 大鼠脂肪间质干细 胞成脂诱导分化培养基 A 液｡ 诱导 3 d 后,吸走 6 孔板中的 A 液,加入 2 ml OriCell SD 大鼠脂肪间 质干细胞成脂诱导分化培养基 B 液｡ 24 h 后,吸走 B 液,换回 A 液进行诱导｡ A 液和 B 液交替作用 5 次后,继续用 B 液维持培养 4 ~ 7 d 直到脂滴变得 足够大和圆｡ B 液维持培养期间,每隔 2 ~ 3 d 换用 新鲜的 B 液｡ 移除细胞培养基,用油红 O 进行染 色,步骤如下:用 PBS 洗两次,加油红 O 固定液固定 20~ 30 min;弃去固定液,用双蒸水洗 2 次;加入 60%异丙醇浸洗 5 min;弃去 60%异丙醇后加入新配 制好的油红 O 染色剂,浸染 10 ~ 20 min;弃去染色 液,水洗 2~5 次,直到无多余染液;加入双蒸水覆盖 细胞显微镜下 200 倍视野下计数脂滴形成数量｡

1. 7 统计学分析 采用 SPSS20. 0 软件进行单因素 方差 分 析､ Tukey 检 验｡ 采 用 GraphPad Prism5. 0 作图｡

2、结果

2. 1 SAL 和低氧预处理协同促进 rASCs 增殖 BrdU 阳性细胞代表 DNA 合成期( S 期) 的细胞｡ 与 NC 组比较,NS 组 BrdU 阳性率明显增加(P< 0. 05);与 HC 组比较,HS 组以上指标明显增加(P< 0. 05)｡ 见图 1､表 1｡ 提示 SAL 和低氧预处理协同 促进 rASCs 增殖｡

2. 2 SAL 和低氧预处理协同促进 rASCs 迁移 与 NC 组比较,NS 组､HC 组和 HS 组每个视野下的平 均迁移细胞个数明显增加,且 HS 组的迁移细胞数 显著高于 NS 组)｡ 见表 1､图 2｡ 表明 SAL 和低氧预处理协同促进 rASCs 迁移｡ 2. 3 SAL 和低氧预处理协同促进 rASCs 成骨分化 与 NC 组比较,NS 组､HC 组和 HS 组每个视野下 的平均钙化结节个数明显增加,且 HS 组以上指标 明显高于 NS､HC 组见表 1､图 3｡ 表明 SAL 和低氧预处理协同促进 rASCs 成骨分化｡

2. 4 SAL 预处理抵消低氧预处理对 rASCs 成脂分 化的促进作用 与 NC 组相比,HC 组的脂滴形成数 明显增加,而 NS 组显著减少;与 NS 组比 较,HC 组明显增加)｡见表 1､图 3｡ 提 示低氧预处理促进 rASCs 成脂分化,SAL 预处理与 其作用相反,而且 SAL 预处理可抵消低氧预处理对 rASCs 成脂分化的促进作用｡

图1 SAL 和低氧预处理对 rASCs 增殖的影响(BrdU 染色,×200)

图2 SAL 和低氧预处理对 rASCs 迁移的影响(结晶紫染色,×200)

图3 SAL 和低氧预处理对 rASCs 成骨分化和成脂分化的影响

3、讨论

ASCs 具有多向分化潜能,在体外可被诱导分化 为脂肪细胞和成骨细胞等中胚层细胞类型｡ ASCs 虽然具有取材方便､获取数量大等优点,但往往受移 植局部微环境的影响,使其增殖､迁移和分化能力受 限｡ 低氧处理及药理学修饰均可改善干细胞的功 能｡ 研究发现,低氧预处理是优化间充质干细胞 (MSCs)的自我更新能力和提高其扩增效率的一种 有希望的策略,低氧张力或低氧均可提高 MSCs 的 存活和功能〔4,11~ 13〕 ｡ 此外,天然药物也对干细胞的 功能也有多种调节作用｡ SAL 是我国的传统天然药 物红景天的主要有效成分之一,具有多种药理学作 用〔14〕 ｡ 研究报道,SAL 可以促进 MSCs 的增殖､分化 及抗凋亡〔15,16〕 ,提示 SAL 可能协同低氧预处理进一 步增强干细胞的功能｡ 本研究证实了 SAL 和低氧 预处理协同促进 ASCs 体外增殖和迁移能力,提示 SAL 预处理可能进一步提高低氧预处理 ASCs 在体 内定植及归巢能力｡

本研究结果发现,低氧预处理促进 ASCs 成骨 和成脂分化,SAL 协同促进成骨分化但抑制成脂分 化｡ 研究证实,干细胞分化是由可诱导特定细胞谱 系的分化因子和信号通路调控的动态平衡过程〔17〕 ｡ MSCs(包括 ASCs 和 BMSCs)来源于中胚层,且具有 自我更新和多向分化潜能,可被诱导分化为肌肉､ 骨､软骨､脂肪和结缔组织的细胞,在组织工程和再 生医学中占据重要地位〔18〕 ｡ 转录因子 Runt 相关转 录因子(Runx) 2 和转录因子 SP7(Osx) 在 MSCs 的 成骨分化过程中起关键作用〔19,20〕 ;脂肪决定分化因 子(ADD)1､CCAAT 增强子结合蛋白(C / EBP) α 和 β､过氧化物酶体增强子激活受体(PPAR) δ 和 γ 等 则参与干细胞成脂分化的过程〔21〕 ｡ 推测低氧预处 理和药物预处理可能通过调控关键分化因子和信号 通路,影响干细胞的定向分化潜能｡

不同氧浓度对MSCs 成骨分化的影响不同｡ Xu 等〔22〕发现,1% 氧浓度通过上调 Notch1 直接抑制 Runx2 转录活性,从而抑制 MSCs 成骨分化｡ 刘林 奇等〔23〕发现,1%氧浓度不影响人来源的 ASCs 成骨 分化｡ 此外,Brown 等〔24〕 发现,5% 氧浓度下培养 BMSCs 72 h,可通过抑制 hedgehog 激活成骨信号通 路｡ 本研究结果与研究〔24〕 类似｡ 说明不同氧浓度 对于不同来源的 MSCs 产生不同的效应｡ 此外,本 研究发现,常氧下单独使用 SAL 预处理也可促进 ASCs 成骨分化,SAL 与低氧联合预处理具有协同效 应,其作用的具体分子机制还有待研究｡

研究表明,在低氧下诱导 MSCs 成脂分化较常 氧下诱导的效率显著降低〔23,25〕 ,但经过不同氧浓度 的低氧预处理后,MSCs 在常氧下的成脂分化的能力 明显增强〔25〕 ,而且本研究的结果与之一致｡ 伍志伟 等〔26〕发现,黄芪多糖通过增加过氧化物酶体增殖物 激活受体(PPAR)-γ2 和脂蛋白脂肪酶( LPL) 促进 低氧环境中的 BMSCs 成脂分化,说明天然药物的活 性成分可通过调控干细胞分化相关因子影响 MSCs 成脂分化｡ 王树海等〔27〕 通过对 SAL 药理活性的研 究证实,SAL 可能通过下调 PPAR-γ 和 C / EBP-α 表达抑制脂肪细胞分化｡ 本研究也证实了 SAL 预处 理对 ASCs 成脂分化的抑制作用,首次报道了 SAL 预处理可以抵消低氧预处理对 ASCs 成脂分化的促 进作用｡

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(81970056);广东省自然科学基金资助项目(2019A1515011925);

文章来源:颜奕光,钟平,兰小中,等.红景天苷和低氧预处理对脂肪干细胞功能的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(24):5993-5997.