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姜黄素对嗜铬细胞瘤细胞系PC12增殖及侵袭的影响

2024-12-30 88 上传者：管理员

摘要：目的研究姜黄素对嗜铬细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的作用。方法用不同浓度的姜黄素处理大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖，计算IC50;采用划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell小室法检测细胞侵袭能力；采用流式细胞测量术检测细胞凋亡；qPCR检测细胞凋亡和抗凋亡基因（Bax和Bcl-2）的mRNA表达，Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达。结果姜黄素（10～80μmol/L）呈浓度依赖性抑制PC12细胞增殖，IC50为29μmol/L。姜黄素呈浓度依赖性抑制PC12细胞迁移，对照组迁移率为66%,姜黄素10μmol/L组、20μmol/L组和30μmol/L组迁移率分别为51%、5%和0.5%。姜黄素（20～30μmol/L）能显著抑制PC12细胞侵袭（P<0.000 1）。此外，姜黄素显著促进PC12细胞凋亡，姜黄素10、20和30μmol/L组凋亡细胞比对照组分别升高2.25%、18.53%和26.89%。姜黄素处理后，Bax基因mRNA和蛋白表达显著升高，Bcl-2基因mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.05）。结论姜黄素可显著抑制PC12细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，其促凋亡作用可能与Bax和Bcl-2基因表达改变有关。

关键词：
PC12细胞
PCC
PGL
侵袭
姜黄素
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嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma, PCC)/副神经节瘤(paraganglioma, PGL)(合称PPGL)是分别起源于肾上腺髓质及肾上腺外副神经节的神经内分泌肿瘤，年发病率2～8/100万人[1]。10%～20% PPGL发生转移，无法经手术治愈，可选择全身治疗，如化疗、靶向治疗及放射性核素治疗等。但部分患者经过上述治疗后肿瘤仍进展，进一步治疗非常困难，因此，寻找新的治疗药物是非常必要。

姜黄素(curcumin, Cur),是一种天然酚类化合物，是从中药姜黄中提取的一种有效活性成分。既往研究表明，姜黄素可对多种肿瘤发挥抗肿瘤作用，如食管癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等。本文拟在体外实验中研究姜黄素对嗜铬细胞瘤细胞系PC12的增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响，以期为PPGL的治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：

大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12(普诺赛公司)。

1.1.2 试剂：

姜黄素，纯度98.16%(MedChemExpree公司，货号HY-N0005)。RPMI 1640细胞培养基(购自中国医学科学院国家生物医学实验细胞资源库);胎牛血清(Gibco公司);BCA蛋白浓度检测试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司);TRIzol RNA提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司);反转录试剂盒(TaRaRa公司);CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);细胞周期检测试剂盒、annexin V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)。β-tubulin一抗、Bax兔单克隆抗体、Bcl-2兔单克隆抗体、辣酸根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测细胞活性：

PC12细胞调整浓度为5×104细胞/mL,每孔以100 μL接种于96孔培养板中，培养24 h。分别用0、10、20、30、40、60、80 μmol/L的姜黄素处理细胞24 h、48 h和72 h, 每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h。酶标仪检测450 nm处的吸光光度值(optical density, OD),计算细胞增殖率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)× 100%。

1.2.2 细胞划痕实验检测细胞迁移：

PC12细胞调整浓度为5×105个/mL,每孔2 mL接种于6孔板。在细胞汇合度达70%～80%时，用不同浓度的姜黄素(0、10、20、30 μmol/L)处理细胞。分别在0 h和12 h, 倒置显微镜观察划痕区域面积的变化情况。Image J软件计算划痕面积。细胞迁移率=(1-An/A0)×100% (A0为0 h划痕面积，An为计时点划痕面积)。

1.2.3 Transwell小室法检测细胞侵袭：

PC12细胞接种于6孔板并用不同浓度姜黄素处理细胞24 h(具体方法同1.2.2)。收集细胞，用RPMI 1640基础培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为8×105个/mL。取100 μL接种于已经铺好Matrigel基质胶的Transwell上室中，下室加入含20%血清的完全培养基600 μL。12 h后，将细胞用4%多聚甲醛固定20 min、结晶紫染色15 min, PBS清洗。擦去小室上层细胞，倒置显微镜下观察拍照。Image J软件计算侵袭细胞数量。细胞侵袭率=(对照组细胞数-实验组细胞数)/对照组细胞数×100%。

1.2.4 AnnexinV-APC/PI双染检测细胞凋亡：

调整PC12细胞浓度为1×105个/mL,接种于12孔板中，培养24 h。用不同浓度(0、10、20、30 μmol/L)的姜黄素处理细胞24 h, 收集并调整细胞浓度为5×105个/mL,加入500 μL的binding buffer轻轻吹匀成单细胞悬液；每个样品加入5 μL annexinV-APC和5 μL PI染液，轻轻吹匀；室温避光反应10 min, 在30 min内进行上机检测，用FlowJo 10.0软件进行数据的分析和作图。

1.2.5 RT-qPCR检测mRNA表达：

PC12细胞(浓度5×105个/mL)接种于6孔板中培养24 h。用不同浓度(0、10、20、30 μmol/L)的姜黄素处理24 h, 收集细胞。根据TRIzol试剂盒说明提取细胞总RNA。根据反转录试剂盒说明书进行反转录，所获取的cDNA作为PCR反应模板，用实时荧光定量PCR仪扩增目标基因。β-actin上游引物：5′-GGAGATTA CTGCCCTGGCTCCTA-3′,β-actin下游引物：5′-GAC TCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′;Bax上游引物：5′-CGAATTGGCGATGAACTGGA-3′,Bax下游引物：5′-CAAACATGTCAGCTGCCACAC-3′;Bcl-2上游引物5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′,Bcl-2下游引物5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s; 反应45个循环；72 ℃终延伸2 min。以β-actin为内参基因，目的基因的mRNA的相对表达量根据Ct值计算2-△△Ct,使用Graphpad Prism10.0软件进行数据可视化。

1.2.6 Western blot检测蛋白质表达：

各组细胞用预冷的PBS清洗，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min, 离心，收集上清。BCA法进行蛋白质定量，100 ℃煮沸5 min变性。配胶、上样、蛋白质电泳、转膜、密封、抗体孵育(β-tubulin一抗、Bax兔单克隆抗体、Bcl-2兔单克隆抗体均1∶1 000稀释，二抗1∶3 000稀释)、ECL发光液显影，最后应用化学发光成像仪拍照并计算蛋白质相对表达量。以β-tubulin作为内参。

1.3 统计学分析

用SPSS26.0和Graphpad Prism10.0软件进行统计学分析。所有实验独立重复3次，以均值±标准差

表明计量资料，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 姜黄素对PC12细胞增殖的影响

不同浓度(10、20、30、40、60、80 μmol/L)姜黄素均抑制PC12细胞增殖，且这种作用呈时间和浓度依赖性(图1A)。处理48 h后，计算姜黄素IC50为29 μmol/L(图1B)。

图1 姜黄素对PC12细胞增殖的影响

2.2 姜黄素对PC12细胞迁移和侵袭的影响

姜黄素处理12 h, 观察到其对细胞迁移的抑制呈剂量依赖性，浓度越高，对细胞迁移的抑制越明显。对照组迁移率为66%,姜黄素10 μmol/L组、20 μmol/L组和30 μmol/L组迁移率分别为51%、5%和0.5%(图2A)。

与对照组相比，姜黄素20 μmol/L和30 μmol/L两组侵袭能力显著减弱(P<0.05)(图2B)。

2.3 姜黄素对PC12细胞凋亡的影响

由图3可知，姜黄素10、20和30 μmol/L组凋亡的PC12细胞比对照组分别升高2.25%、18.53% 和26.89%,20 μmol/L和30 μmol/L组与对照组比较差异明显(P<0.01),提示姜黄素可诱导PC12细胞的凋亡。

2.4 姜黄素对PC12细胞Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白表达的影响

由图4可知，与对照组相比，姜黄素20、30 μmol/L组Bax基因mRNA表达显著升高；姜黄素10、20、30 μmol/L组Bcl-2基因的mRNA水平显著降低(P<0.05)。与对照组相比，姜黄素30 μmol/L组Bax蛋白水平显著增高，而Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。

3、讨论

姜黄素是从姜黄的根茎中提取的成分，具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等多种药理作用[2]。在抗肿瘤方面，姜黄素能抑制食管癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞的增殖并促进其凋亡[3-5];抑制肺癌细胞、结肠癌细胞的迁移和侵袭[6-7];对肝癌、结肠癌的化疗药物有增敏作用、逆转耐药性等[8-9]。此外，姜黄素还对人结肠癌细胞系SW620的小鼠异种移植瘤模型具有抑制肿瘤生长的作用[10]。除了细胞和动物模型的研究，在多发性骨髓瘤、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤中也有相关临床试验证实姜黄素及其衍生物能够延缓肿瘤进展、改善了组织学病变的状况[11-13]。例如多西他赛和姜黄素联合治疗晚期乳腺癌的临床实验发现，14例患者中有8例可测量病变，其中5例部分缓解，3例病情稳定。在大多数患者中观察到一些生物学和临床反应的改善[13]。

既往使用PC12细胞进行的神经退行性疾病研究中，发现姜黄素通过调节TREM2/TLR4/NF-κB/JNK 信号通路，抑制神经炎性反应，发挥其神经保护作用[14]。目前尚没有姜黄素对PC12细胞增殖、迁移、侵袭等方面的报道。本研究探讨了姜黄素在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中的生物学效应，结果表明姜黄素能有效抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。

图2 姜黄素对PC12细胞迁移(A)、侵袭(B)的影响

图3 姜黄素对PC12细胞凋亡的影响

图4 姜黄素对PC12细胞的Bax和Bcl-2基因mRNA表达(A,B)和蛋白表达(C～E)的影响

姜黄素抑制PC12细胞增殖及凋亡的机制尚不清楚。既往研究表明姜黄素可有效抑制食管癌细胞(Ec-9706)增殖，其机制可能跟 PI3K/AKT/mTOR信号通路有关[3]。此外，姜黄素通过激活凋亡信号通路来诱导细胞凋亡，如在胃癌中，它能够上调p53和Bax的表达，同时下调Bcl-2的水平，最终激活caspase级联反应，触发细胞凋亡[4]。而在结肠癌细胞中，姜黄素诱导结肠癌细胞系SW480凋亡的机制可能与调控Notch1信号通路中膜受体基因Notch1及下游靶基因Hes-1转录有关[5]。本研究发现姜黄素促进PC12细胞凋亡，并上调Bax的表达且下调Bcl-2表达，推测其促凋亡机制可能与胃癌类似。姜黄素对细胞迁移和侵袭的抑制作用在多种肿瘤模型中均有报道。在肺癌中，姜黄素能够下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表达[6],MMPs是肿瘤细胞侵袭和转移的关键因素。此外，它还能抑制上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),这是肿瘤细胞获得侵袭能力的重要过程。在PC12细胞中姜黄素抑制迁移和侵袭的机制尚不清楚。

综上所述，姜黄素可显著抑制PC12细胞增殖、侵袭和迁移，诱导PC12细胞凋亡。然而本研究仅限于体外细胞实验，后续将进行体内实验进一步证实此结论，从而为PPGL的治疗提供理论依据。

参考文献:

[1]中华医学会内分泌学分会.嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗专家共识(2020版)[J].中华内分泌代谢杂志,2020,36:737-750.

[2]王莉娟,张国霞,刘海龙,等.姜黄素抗肿瘤作用及其作用机制研究进展[J].甘肃中医药大学学报,2022,39:78-82.

[3]涂启敏,黄宏灵.PI3K/AKT/mTOR在姜黄素抑制食管癌细胞增殖中的作用[J].解剖学研究,2018,40:174-177.

[5]刘少琼,杨芳,禹正杨,等.姜黄素调控Notch1信号通路诱导结肠癌SW480细胞株凋亡[J].湖南中医药大学学报,2015,35:13-16.

[7]陈海滔.姜黄素调控NKD2-Wnt-CXCR4通路抑制结肠癌细胞的侵润转移[D].杭州:浙江中医药大学,2017:10-13.

[8]曹聪,黄桂柳,黄赞松,等.姜黄素对肝癌耐药细胞HepG2/ADM的增殖和阿霉素耐药性的影响[J].广西医学,2020,42:976-980.

[9]徐露,张鑫杰,张闰哲,等.姜黄素逆转结肠癌HCT-116/5FU细胞耐药作用机制研究[J].浙江中西医结合杂志,2020,30:454-457+524.

[14]佟凤芝,曾常茜,王建华.姜黄素在神经元退行性疾病中的应用研究进展[J].中国中医药科技,2016,23:628-629+631.

基金资助:国家重点研发计划(2021YFC2501600,2021YFC2501603);中央高水平医院临床研究专项(2022-PUMCH-C-028);中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-C&T-B-002,2021-I2M-1-007);

文章来源:张文倩,周玥,任卫东,等.姜黄素对嗜铬细胞瘤细胞系PC12增殖及侵袭的影响[J].基础医学与临床,2025,45(01):38-43.