妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期间发生的一种糖尿病类型[1]。GDM的存在可能会导致新生儿肥胖和巨大儿，并且会增加难产的风险[2]。因此及时发现以及控制GDM的进展对母亲和胎儿都有着重大的意义。

Hsa-miR-483基因是哺乳动物保守的miRNA,位于11p15.5染色体区域的人胰岛素生长因子2 (IGF2)基因的第2个内含子上[3]。有研究表明，体内miR-483-3p的表达增加会限制脂质在脂肪组织中的储存，从而引起脂肪毒性和胰岛素抵抗，进而增加对代谢性疾病的易感性[4]。更值得关注的是在血糖正常的孕妇和GDM患者的血液样本中鉴别了多个差异表达的微RNAs(microRNAs, miRNAs),其中miR-483-3p表达水平在GDM患者中上调3.99倍[5]。

miR-483-3p虽然被证实与糖尿病以及人体相关功能有密切的联系，但是在GDM患者中的作用研究甚少。因此本研究中旨在探索miR-483-3p在GDM中的临床价值以及对妊娠期糖尿病发生发展的预测价值。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人群及细胞系：

1)根据纳入标准，随机选取2022年1月至2023年12月在安丘市人民医院产科常规产检的24～32孕周等的GDM的患者100例，作为GDM组。纳入标准：①年龄在18～45周岁；②单胎妊娠；③符合GDM的诊断标准。排除标准：①辅助生殖；②孕前诊断糖尿病；③孕24周前血糖升高的早发妊娠高血压患者；④合并甲状腺功能亢进；⑤妊娠期合并恶性肿瘤。并选取同期在产科产检的同年龄段24～32孕周的98例健康孕妇作为糖耐量正常(normal glucose tolerance, NGT)组。样本量的计算是采用G*Power3.1软件计算得出，α err prob值为0.05,组一最低样本量为88,组二最低样本量为88,Actual power值为0.95。本研究纳入的样本量符合要求。依据国际糖尿病妊娠研究小组(IADPSG)的诊断标准：孕妇早晨空腹状态下1次性口服75 g的葡萄糖，在摄入葡萄糖前和摄入葡萄糖后的1 h, 2 h测定外周血葡萄糖浓度(mmol/L),阈值分别为5.1、10.0、8.5,任一值超出阈值即诊断为妊娠期糖尿病[6]。所有研究人员均理解研究过程并自愿入组。本研究已经被安丘市人民医院医学伦理委员会批准(伦理编号：202301006),同时，所有参与者都已签订知情同意书。2)人绒毛膜滋养层细胞系(HTR-8/SVneo细胞)(ATCC公司)。

1.1.2 试剂：

TRIZOL试剂(ThermoFisher Scientific公司);反转录试剂盒(TaKaRa公司);Ultra SYBR mixture试剂盒(康为世纪生物科技公司);DMED培养基(Hyclone公司);CCK-8试剂(同仁化学公司);凋亡试剂盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 一般指标的测定：

1)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)数据及孕前体质量均来自孕产妇产检手册。2)记录每位研究对象的年龄、身高、孕周等基本资料，计算体质指数(BMI)=体质量(kg)/身高2(m2)。两组人员的年龄、孕周和BMI的差异均无统计学意义。3)抽取每一位实验参与者的空腹静脉血5 mL,并在临床检验中心进行检测，得到的结果包括空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、餐后1小时血糖(P1hBG)、餐后2小时血糖(P2hBG)、空腹胰岛素(fasting insulin serum level, FINS, mIU/L)、胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)、空腹 C 肽、三酰甘油(triglycerides, TG, mmol/L)、总胆固醇(total cholesterol, TC, mmol/L)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C, mmol/L)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C, mmol/L)等指标。GDM组的FBG、P1hBG、P2hBG、FINS、HOMA-IR、空腹C肽和TC的水平均显著高于NGT组，并且均具有统计学差异(P<0.05)。4)另外抽取5 mL外周静脉血样本，3 000 r/min离心15 min后，取血清以进行相应指标的检测或储存于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 血清miR-483-3p的表达的检测：

RT-qPCR采用Trizol试剂提取血清和细胞中的总RNA, 用反转录试剂盒合成cDNA。用Ultra SYBR mixture试剂盒进行实时聚合酶链反应，miR-483-3p的引物序列为：5′-UCACUCCUCUCCUCCCGUCUU-3′。 反应条件为：95 ℃预变性 10 min, 95 ℃变性15 s, 62 ℃退火1 min, 共40个循环。采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.3 细胞的培养与转染：

采用使用含10%胎牛血清的普通或高糖(25 mmol/L)DMED培养基培养HTR-8/SVneo细胞，并使用含10%胎牛血清的普通或高糖(25 mmol/L)DMED培养。将细胞接种到24孔培养皿中，使用Lipofectamine 2000将miR-483-3p 抑制剂或抑制剂对照(inhibitor-NC)、 靶向ATG7的siRNA(si-ATG7)或其对照(si-NC) 转染至HTR-8/SVneo细胞。细胞在37 ℃,5% CO2培养箱培养24 h。将细胞接种到24孔培养皿中，使用Lipofectamine 2000将miR-483-3p 抑制剂或抑制剂对照(inhibitor-NC)、 靶向ATG7的siRNA(si-ATG7)或其对照 (si-NC) 转染至HTR-8/SVneo细胞。细胞在37 ℃,5% CO2培养箱培养24 h。

1.2.4 CCK-8法检测细胞的增殖：

将HTR-8/SVneo细胞接种96孔板，每组设3个平行孔，在 12 h后，将 HG 组的培养基更换为 25 mmol/L高糖培养基，然后继续培养 12 h。进行miR-483-3p相关基因转染，转染0、24、48、和72 h后，在96孔板的每个孔中轻轻加入10 μL的CCK-8试剂。添加 CCK-8试剂之后，将样本置于CO2培养箱中，继续进行 2～4 h的孵育，利用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.2.5 流式细胞测量技术检测细胞凋亡：

用0.125%的胰蛋白酶消化细胞3 min, 收集细胞，然后1 000 r/min离心3 min。使用PBS进行1次清洗，然后1 000 r/min离心3 min。离心完成后，弃去上清液，利用1×Annexin-binding 缓冲液将细胞重悬，添加 Alexa Fluor 488 annexin Ⅴ(component A) 和PI工作液，在室温和避光环境下继续孵育15 min。孵育完成后，加入annexin-binding 缓冲液，并混合均匀。随后，将样本置于冰块上或 4 ℃的冰箱中，准备流式检测。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：

按照说明书，将单细胞悬液接种到Transwell的上室，并孵育24 h。随后，用PBS清洗细胞，然后用甲醛固定，最后用结晶紫染色。通过在至少选择5个随机的领域中进行细胞计数。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验检测ATG7与miR-483-3p的靶向关系：

将野生型(WT)和突变型(MUT)的ATG7基因的3′UTR分别插入pmirGLO载体 (Promega, China)。然后使用Lipofectamine 2000将这些载体转染进入HTR-8/SVneo细胞。随后，将ATG7-WT或ATG7-MUT和miR-483-3p mimic或mimic NC、miR-483-3p inhibitor或inhibitor NC同时转染HTR-8/SVneo细胞。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h, 收集细胞，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

使用SPSS 26.0和 Graphpad Prism 9处理和分析数据。计量资料以均值±标准差

表示，两组样本比较时使用独立样本t检验，多组样本比较时使用单因素方差分析(One-way Anova)。用卡方检验分析miR-483-3p与临床指标的相关性。用 Logistic回归分析评价影响GDM发生的危险因素。用皮尔森相关性分析法分析miR-483-3p与ATG7的相关性。

2、结果

2.1 miR-483-3p的表达水平和临床诊断价值

GDM组血清miR-483-3p的相对表达量为1.63±0.41,高于NGT组miR-483-3p的表达量(P<0.001)。miR-483-3p诊断GDM的ROC曲线下面积(AUC)为0.878,敏感度为81%,特异度为79.59%(图1)。

图1 miR-483-3p的诊断GDM的ROC曲线

2.2 GDM组miR-483-3p的表达量与临床指标的相关性分析

将GDM组患者分为低表达组和高表达组。孕前BMI、FBG、FINS、HOMA-IR和TG与血清miR-483-3p的表达有显著相关性(表1)。

2.3 GDM患者发病风险因素的Logistic回归分析

以miR-483-3p表达量为因变量，以与GDM组的孕前BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、TG的平均水平分为高水平和低水平，二元Logistic回归分析结果显示，孕前BMI(OR=2.729,P<0.05)和TG(OR=2.534,P<0.05)是GDM发病的独立影响因素，结果见表2。

2.4 miR-483-3p对HTR-8/SVneo细胞功能的影响

HG处理HTR8-/SVneo细胞后，miR-483-3p 在细胞内的表达水平显著增加(图2A,P<0.001)。与HG+inhibitor NC相比，miR-483-3p 抑制剂显著降低miR-483-3p的表达(图2B)(P<0.01)。 HG处理细胞后，增值能力下降，但是miR-483-3p 抑制剂显著增强了HG处理后的细胞的增殖能力(图2C)(P<0.05)。miR-483-3p 抑制剂也逆转了HG引起的细胞凋亡的增强(图2D)(P<0.001)。在迁移和侵袭实验中，miR-483-3p 抑制剂逆转了HG引起的细胞迁移和侵袭数量的降低(图2E,F)(P<0.01)。

表1 GDM组miR-483-3p的表达水平与患者临床指标的相关性

表2 GDM患者发病的风险因素Logistic回归分析

图2 miR-483-3p抑制剂对HG处理的HTR-8/SVneo细胞功能的影响

2.5 miR-483-3p通过靶基因ATG7调控细胞功能

ATG7在GDM患者血清中表达显著降低 (图3A,P<0.001)。并且ATG7的表达与miR-483-3p的表达呈显著负相关性(图3B)(r=-0.6401,P<0.001)。通过数据库 miRDB 和 miRWalk在线数据库搜索 miR-483-3p的靶基因，ATG7可能含有与 miR-483-3p结合的位点(图3C)。双荧光素酶报告基因实验显示(图3D), ATG7-WT与miR mimic共转染细胞后，荧光素酶活性显著降低(P<0.001),而ATG7-WT与miR inhibitor共转染细胞后，荧光素酶活性显著升高(P<0.001)。

在转染miR-483-3p 抑制剂后，ATG7的表达显著升高(P<0.05),并且在共转染miR-483-3p 抑制剂和si-ATG7后，细胞中ATG7的表达量显著降低(P<0.001)(图3E)。Si-ATG7可以逆转miR-483-3p 抑制剂对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(图3F～I)。

3、讨论

胰岛素是控制血糖的重要激素，在妊娠期间，胰岛素的需求量增加，使孕妇对胰岛素的敏感性降低。胰腺β细胞在维持葡萄糖稳态中起关键作用，其调节和控制胰岛素水平的能力在很大程度上决定了糖尿病的进展[7]。脂代谢紊乱也是GDM的特征之一，在女性中， 肥胖的增加导致GDM以及相关的妊娠和围产期并发症的发病率增加[8]。本研究发现GDM患者的HOMA-IR和TC水平明显升高，说明GDM患者的胰岛素敏感性下降，并且妊娠期间的肥胖和脂肪积累可能也与妊娠期糖尿病的发展有密切的关系。

图3 miR-483-3p通过靶基因ATG7调控细胞功能

miRNA与包括心血管疾病在内的各种病理过程的发生和进展密切相关。比如高血糖及高胰岛素能降低人血管平滑肌细胞中miR-145的表达[9]。研究发现，miR-483-3p可以显著调节脂肪细胞分化和储存脂质的能力，引起脂肪毒性和胰岛素抵抗，从而增加对代谢疾病的易感性，导致异位三酰甘油沉积、胰岛素抵抗以及2型糖尿病[10]。为了确证miR-483-3p与GDM的联系，本研究对比了两组患者的血清miR-483-3p的表达水平，发现miR-483-3p可能与GDM的病理生理存在密切的联系。并且本研究发现孕前BMI和TG是GDM患者发病的风险因素，进一步验证了GDM与肥胖和脂肪积累有密切的联系。并且GDM患者的临床指标与血清miR-483-3p的表达有显著相关性，说明了miR-483-3p与GDM的发生有密不可分的关系。

ATG7(autophagy-related protein 7)是一种自噬相关蛋白。研究发现，miRNA通过调节自噬在GDM起到重要的作用。自噬在胎盘的形成和滋养细胞的增殖、凋亡、侵袭等过程中发挥了重要的作用[11]。ATG7作为自噬过程中的关键蛋白，在多个环节发挥作用。糖尿病肾病患者的血清中，自噬相关蛋白 Beclin1和 ATG7的表达水平有所下降[12]。本研究验证了miR-483-3p和ATG7的靶向关系，并且发现ATG7沉默可以逆转miR-483-3p inhibitor对细胞增殖能力、凋亡率、迁移和侵袭能力的影响。提示miR-483-3p通过下调ATG7的表达参与GMP的发生与发展。

人们生活水平的越来越高，GDM的发病率也逐渐上升。本研究提出了miR-483-3p的表达与GDM的病理生理存在密切的关联，为GDM的诊断提供了新的思路与策略，但是研究样本量还不够大，并且对于miR-483-3影响糖尿病的其他机制需要更深一步的探究。

参考文献､:

[9]金成吉,唐田,于晓静,等,高糖及高胰岛素对人血管平滑肌细胞增殖､迁移及miR-145水平的影响[J].基础医学与临床,2017,37:94-97.

[11]肖文霞,王会芝.细胞自噬与妊娠[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2018,37:141-144.

[12]贾艳燕,刘婷,方敬爱,等.糖尿病肾病患者血清Beclin1､ATG7与蛋白尿相关性研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2022,23:228-230.

基金资助:潍坊市科技局科研基金(2022YX027);

文章来源:张丽娜,贾梦涛,孙泽云,等.miR-483-3p在妊娠期糖尿病患者血清中的表达及临床意义[J].基础医学与临床,2025,45(01):91-97.