慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）是一种临床常见的难治性疾病。“慢性浅表性胃炎→CAG→肠化→不典型增生→胃癌（gastric cancer,GC）”被认为是胃癌的经典演化模式，CAG伴肠化和异型增生者，GC发病率高达6%。CAG为胃“炎癌转化”的关键环节，有效防治CAG对于降低GC的发生率和病死率具有重要意义[1-2]。目前，西医治疗CAG短期效果明显，但临床症状容易反复[3]。中医药治疗CAG有较好临床疗效。

慢性萎缩性胃炎可归属于中医“胃脘痛”“胃痞”范畴。首届全国名中医蔡淦教授认为此病具有本虚标实、虚实夹杂的特点，病变以脾胃虚弱为本，痰湿热毒、气滞血瘀为标，故在此基础上，创制了莪连颗粒，功在健脾益气、活血化瘀、清热解毒、祛湿化痰。该方在临床应用已30多年，取得了良好的疗效[4-5]。早期动物实验研究[6-8]显示，莪连颗粒能够逆转N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）造模大鼠胃黏膜上皮细胞的异型性。网络药理学研究[9]揭示莪连颗粒可能通过调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等干预萎缩性胃炎癌前病变（PLGC）。

转录组学技术有助于研究基因组结构和功能，在建立应对疾病的分子生物标志物、药物作用靶点方面发挥着重要作用[10-11]。Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3）信号通路在CAG等消化系统疾病中发挥着重要作用[12-14]。JAK2对STAT3表达发挥正反馈调节作用[15]。STAT3是多条信号通路的交汇点，在多种恶性肿瘤的组织、细胞中存在着过度表达[16]。研究[17]发现，浅表性胃炎、CAG伴肠化、不典型增生和GC中磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3）的阳性表达率呈逐步升高趋势。当JAK2/STAT3被过度激活时，其负反馈调节器细胞因子信号抑制因子3(SOCS3）表达增加[18]。B淋巴细胞瘤-2基因蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）在CAG等消化道疾病发生、发展中扮演了重要角色[19-22]。Bcl-2可与其他促凋亡蛋白形成异质二聚体，抑制细胞凋亡；Bax可以提高细胞凋亡的敏感性，促进细胞凋亡。JAK2/STAT3信号通路激活后，p-STAT3可调控Bcl-2、Bax蛋白表达从而抑制细胞凋亡[23-24]。

本研究通过MNNG综合法构建CAG大鼠模型，苏木精-伊红（HE）染色观察胃窦组织病理，转录组学法进行生物信息学分析，蛋白免疫印迹（Western blot）法检测胃窦组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3、Bcl-2、Bax蛋白表达，以期进一步探讨莪连颗粒治疗CAG的机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

18只6周龄无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠由广西医科大学动物实验中心提供。动物生产许可证号：SCXK（桂）2020-0003。动物使用许可证号：SYXK（桂）2020-0004。实验动物饲养于SPF级屏障环境中，相对湿度50%～70%，温度（24±1）℃，明暗交替周期12 h/12 h。本实验方案获得广西医科大学实验动物管理伦理委员会批准（伦理批准号：202007054）。

1.1.2 药物与试剂

莪连颗粒组成：莪术15 g，丹参10 g，当归10 g，黄连3 g，蒲公英30 g，白花蛇舌草30 g，党参10 g，炒白术10 g，甘草6 g，半夏10 g，陈皮6 g，茯苓12 g；由上海中医药大学附属曙光医院提供。

MNNG（批号：M0527），上海梯希爱化成工业发展有限公司；TRIzol、2'-脱氧尿苷5'-三磷酸盐（dUTP）溶液（批号分别为15596018、R0133），美国Thermo Fisher Scientific公司；逆转录酶（批号：1896649），美国Invitrogen公司；E.coli DNA聚合酶I、核糖核酸酶H(RNase H）、尿嘧啶DNA糖基化（UDG）酶、镁离子打断试剂盒（批号分别为m0209、m0297、m0280、E6150S），美国NEB公司；兔单克隆抗体JAK2、兔单克隆抗体p-JAK2、鼠单克隆抗体STAT3、兔单克隆抗体p-STAT3、兔单克隆抗体SOCS3、羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗、马抗鼠HRP标记二抗（批号分别为3230、4406、9139、9145、52113、7074、7076），美国CST公司；兔单克隆抗体Bcl-2、兔单克隆抗体Bax（批号分别为T40056、T40051），上海艾比玛特生物医药有限公司；二辛可酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、组织细胞裂解液（RIPA）（批号分别为P0010、P0013B），上海碧云天生物技术有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶快速制备试剂盒（批号：PG113），上海雅酶生物医药科技有限公司。

1.1.3主要仪器

生物组织包埋机、摊片机（型号分别为KD-BM、KD-P），浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；轮转切片机（型号：MICROM HM325），德国Thermo Fisher Microm公司；光学显微镜（型号：ECLIPSE 80i），日本Nikon公司；电泳仪（型号：164-5050），美国BioRad公司；高灵敏电荷耦合器件成像仪（Amersham ImageQuant，型号：800），上海格莱赛生命科技有限公司；紫外/核酸蛋白检测仪（型号：ND-1000），美国NanoDrop公司；生物分析仪（型号：Agilent 2100），美国Agilent公司；因美纳（illumina）基因测序仪（型号：Novaseq 6000），杭州联川生物技术股份有限公司；冷冻高速离心机（型号：Centrifuge5424），德国Eppendorf公司；摇床（型号：TS-1000），海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 分组与造模

18只6周龄雄性大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组和莪连颗粒组，每组6只。正常组给予SPF饲料、清洁饮水，模型组、莪连颗粒组采用MNNG综合法构建大鼠模型[9]:(1)200 mg/L MNNG溶液锡箔纸包裹避光自由饮用，每24 h更换1次；(2)喂食含体积分数为0.03%盐酸雷尼替丁的颗粒状SPF级大鼠饲料，进食2 d，禁食1 d;(3)禁食当天下午予体积分数为40%的乙醇灌胃，10 m L/kg体质量。

1.3干预

莪连颗粒组大鼠予莪连颗粒水溶液灌胃，灌胃剂量3.24 g/kg[9]，每日1次，每次每只10 m L/kg。正常组、模型组大鼠均予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，每次每只10 m L/kg。各组干预周期均为40周。

各组大鼠末次干预后，禁食、水12 h。体积分数为1.5%的戊巴比妥钠（3 mL/kg）麻醉，腹腔注射，体积分数为75%的乙醇喷洒腹部后，迅速开腹剖取全胃，沿胃大弯侧剖开，取胃窦部组织固定于20 mL多聚甲醛溶液（40 g/L），以备后续石蜡切片。剩余胃窦组织置于-80℃冰箱，以备后续检测。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 大鼠胃窦组织病理情况

采用HE染色检测大鼠胃窦组织病理形态。胃窦组织切片脱蜡，苏木精染色2 min后予流水冲洗5 min，伊红染色90 s后予流水冲洗10 min,60℃烘箱30 min，中性树脂封片，电子显微镜下观察各组大鼠胃窦组织病理。

1.4.2 RNA提取与建库测序

对各组大鼠胃窦组织样品RNA分离纯化。总RNA量及纯度由NanoDrop ND-1000质控，符合浓度>50μg/L、RIN值>7.0、total RNA>1μg则开展下游实验。在高温条件下通过镁离子打断试剂盒对带有PolyA的mRNA进行片段化（94℃，5～7 min）处理，片段化RNA在逆转录酶作用下合成cDNA，通过E.coli DNA聚合酶I与RNase H完成二链合成，掺入dUTP溶液使双链DNA末端被补齐为平末端。随后，通过在其两端各加入一个A碱基的方式使其与末端带有T碱基的接头连接。UDG酶消化二链后通过PCR（预变性95℃，3 min,98℃变性，8个循环，各15 s；退火到60℃，15 s;72℃，延伸30 s；最后延伸72℃，5 min）生成文库（片段大小300bp±50bp),Illumina NovaseqTM6000完成双端测序（模式PE150）。

1.4.3 生物信息学分析

采用fastQC(https：//github.com/OpenGene/fastp）软件质控原始数据（raw data），参数为︱log2FC︱≥1.5,P<0.05，获得高质量的测序数据后通过HISAT2进行基因序列比对，并进行基因表达定量、基因差异分析、富集分析等。

1.4.4 交集靶标富集分析

通过注释、可视化、集成探索（DAVID）数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）对交集基因进行基因功能注释（GO）功能分析和京都基因和基因组百科全书数据库（KEGG）分析，以P<0.05为显著功能和通路的临界值，获取相应数据以绘图。

1.4.5 大鼠胃窦组织相关蛋白表达

采用Western blot法检测各组大鼠胃窦组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3、Bcl-2、Bax蛋白表达。提取大鼠胃窦组织后，各组别依次加入10μL蛋白，80 V电压30 min后转120 V电压80 min，湿转法270～300 mA转膜90～120 min,1倍快速封闭液室温摇床15 min后加入一抗（稀释比例均为1∶1 000),4℃冰箱摇床孵育过夜，封闭洗涤缓冲液（TBST）室温摇床漂洗3次，每次10 min，加入HRP标记的对应种属二抗（稀释比例均为1∶1 000），室温孵育60 min,TBST室温摇床漂洗3次，每次10 min，超敏增强型化学发光（ECL）液显影，ImageJ分析条带灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值反映目的蛋白相对水平。

1.5 统计学分析

采用SPSS 27.0软件统计分析实验数据。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用LSD法组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 9等软件绘图。

2、结果

2.1 对大鼠胃窦组织病理的影响

正常组大鼠胃黏膜上皮结构完整，腺体形态规则，排列整齐；模型组大鼠胃黏膜腺体萎缩，形态不规则，排列紊乱；莪连颗粒组大鼠胃黏膜腺体形态尚完整，排列尚规律。见图1。

2.2 样本相关性分析

通过Pearson相关系数确定样本间重复性情况以辅助排除离群样本，结果显示正常组1和其他组相关性系数偏低，这可能是个体差异造成的；但是经过造模后，模型组内相关性系数非常接近，表明造模成功；经莪连颗粒干预后，与同组其他样本比较，莪连颗粒组3和正常组相关性更高，表明其经莪连颗粒治疗后基本恢复正常水平。见图2。

图1 各组大鼠胃窦组织病理（苏木精-伊红染色，×40或×100)

2.3差异基因分析

2.3.1差异基因数量

与正常组比较，模型组差异基因有3 595个，其中上调基因有1 203个，下调基因有2 392个；与模型组比较，莪连颗粒组差异基因有561个，其中上调基因有174个，下调基因有387个。见图3、图4。

图2 样本相关性分析

图3 差异基因火山图

2.3.2 GO功能分析

GO功能分析主要包括生物学过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）。其中，GO-BP分类主要涉及炎症反应（inflammatory response）、免疫反应（immune response）、调节信号受体活性（regulation of signaling receptor activity）等；GO-CC分类主要涉及细胞质（cytoplasm）、细胞核（nucleus）、细胞膜（membrane）等；GO-MF分类主要涉及蛋白质结合（protein binding）、信号受体结合（signaling receptor binding）、ATP结合（ATP binding）等。见图5。

图4 差异基因聚类热图

图5 GO富集圈图

2.3.3 KEGG通路分析

KEGG通路分析分为以下6类：细胞过程主要包括吞噬体（rno04145）、内吞（rno04144）、焦点黏附（rno04510）等；环境信息处理主要包括细胞因子-细胞因子受体相互作用（rno04060）、PI3K-Akt信号通路（rno04051）、细胞黏附分子（rno04514）等；遗传信息处理主要包括内质网中的蛋白质加工（rno04141）、核糖体（rno03010）、泛素介导的蛋白质降解（rno04120）等；人类疾病主要包括癌症通路（rno05200）、冠状病毒病-新型冠状病毒感染（rno05171）、金黄色葡萄球菌感染（rno05150）等；代谢主要包括代谢通路（rno01100）、药物代谢-细胞色素P450(rno00982）、细胞色素P450对异种生物的代谢作用（rno00980）等；有机体系统主要包括造血细胞谱系（rno04640）、趋化因子信号传导途径（rno04062）、成骨细胞的分化（rno04380）等。见图6。

2.4 对大鼠胃窦组织相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达显著升高（P<0.01,P<0.001),SOCS3、Bax蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，莪连颗粒组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.01,P<0.001),SOCS3、Bax蛋白表达显著升高（P<0.05）。见图7。

图6 KEGG富集圈图

图7 各组大鼠胃窦组织JAK2、STAT3、SOCS3、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

3、讨论

莪连颗粒由党参、莪术、白花蛇舌草、白术、茯苓、蒲公英、黄连、当归、丹参、半夏、陈皮、甘草组成。其中，党参、莪术、白花蛇舌草健脾、活血、清热解毒为主药；白术、茯苓、蒲公英、黄连、当归和丹参为辅药；佐以半夏、陈皮、甘草。方以四君子汤益气健脾，党参易人参，意在久服缓图，脾气健运则气行湿化。佐以半夏、陈皮健脾燥湿化痰以绝痰湿之源。蒲公英、白花蛇舌草清热解毒，配伍四君子汤驱毒而不伤正。丹参、当归辅助莪术活血化瘀，有效改善胃黏膜血供。莪术得党参、白术补气之资，通络不损气，破血不伤血，丹参、白术得莪术之助，补气而不壅。全方虚实兼顾、攻补兼施、寒温并用、辛开苦降、气血同调，主治CAG伴肠化和（或）异型增生者。

CAG动物模型是研究胃炎癌转化进程中的重要环节，目前CAG造模方法仍存在一定争议，也没有形成统一标准。本次实验采用MNNG自由饮+体积分数为40%的乙醇灌胃+饥饱失常+体积分数为0.03%的雷尼替丁饲料喂饲的MNNG综合法复制CAG模型，HE染色结果显示模型组大鼠胃窦部黏膜腺体萎缩、形态不规则、排列紊乱，表明CAG模型复制成功。

借助转录组测序技术，我们对大鼠胃窦组织样本进行基因表达谱比较分析，并且鉴定了差异表达基因和功能性富集通路。首先，进行各样本基因表达值分布统计及样本相关性分析，了解样本间重复性，辅助排除了离群样本。随后，差异基因火山图以及聚类热图结果显示，较之正常组，模型组差异基因有3 595个，其中上调基因有1 203个，下调基因有2 392个；与模型组比较，莪连颗粒组差异基因有561个，其中上调基因有174个，下调基因有387个，提示莪连颗粒可能通过多靶点发挥治疗CAG作用。接下来，进行差异基因GO及KEGG分析。GO-BP分类主要涉及炎症反应、免疫反应、调节信号受体活性等；GO-CC分类主要涉及细胞质、细胞核、细胞膜等；GO-MF分类主要涉及蛋白质结合、信号受体结合、ATP结合等。KEGG通路分析提示莪连颗粒抗CAG作用机制可能与炎症反应、信号转导、免疫应答等途径密切相关，与趋化因子信号传导途径（rno04062）、PI3K-Akt信号通路（rno04051）、癌症通路（rno05200）等密切相关。其中，趋化因子信号传导途径（rno04062)P值显著，JAK2/STAT3通路在趋化因子信号传导途径（rno04062）中发挥着重要作用。因此，课题组选择JAK2/STAT3通路进行后续实验。

已有研究揭示，JAK2/STAT3信号通路在CAG、胃肠道肿瘤等消化系统疾病中发挥着重要作用[25-26]。JAK2是一种酪氨酸激酶，在生物体各组织内广泛表达，对STAT3发挥正反馈调节作用[15]。激活STAT3可调节细胞增殖、凋亡、肿瘤侵袭等[27]。若STAT3功能失调，可引起癌细胞增殖和凋亡进程受损[28]。当JAK2受到细胞外信号刺激，可与细胞受体结合从而发生磷酸化，而后通过磷酸化转录因子STAT3将上游信号传递到细胞核，诱导炎症反应[29]。然而，JAK2抑制剂AG490可抑制IL-6诱导的STAT3表达[30]。JAK2抑制剂ruxolitinib亦可抑制JAK2下游靶点STAT3和（或）SOCS3表达[31]。SOCS具有极强的蛋白抑制作用，是各种信号通路的抑制剂，被形象地称作“分子刹车”。研究[18,32]表明，当JAK2/STAT3被过度激活时，它们的负反馈调节器SOCS3也会增加。而SOCS3启动子甲基化沉默则会使JAK2/STAT3通路高表达，从而导致细胞增殖，反之，SOCS3高表达可抑制JAK2/STAT3通路，增加细胞凋亡[33]。

细胞凋亡在维持组织平衡方面作用显著，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bax等在内的Bcl-2家族已被证明是调节细胞凋亡的重要因素。Bcl-2蛋白可与其他促凋亡蛋白形成异质二聚体，抑制细胞凋亡；Bax可以提高细胞凋亡的敏感性，促进细胞凋亡。随着“慢性浅表性胃炎→CAG→肠化→不典型增生→GC”病情进展，Bcl-2蛋白阳性表达逐渐增高[34]。正常胃黏膜Bax表达率高达88.2%，随着疾病进展，其表达率逐渐降低，在胃腺癌中的表达率已低至43.6%[35]。CAG大鼠Bcl-2蛋白表达升高，而Bax蛋白表达在一定程度上降低[22]。在GC患者中，抗凋亡基因Bcl-2的上调可抵消Bax的促凋亡作用，导致凋亡相关的基因表达失调，从而促进细胞增殖[36]。因此，Bcl-2与Bax异常表达在介导细胞凋亡、参与胃黏膜萎缩中起着重要作用。STAT3作为多条致癌信号通路的交汇基因，可介导下游信号分子Bcl-2参与细胞生长[23,37]。JAK2/STAT3信号通路被激活后，p-STAT3调控Bcl-2、Bax蛋白表达从而抑制细胞凋亡[24,38]。

本研究结果表明，在CAG大鼠胃窦组织中，p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显升高，表明JAK2/STAT3通路被激活，SOCS3蛋白表达降低，导致JAK2/STAT3通路过度活化，Bcl-2蛋白表达升高而Bax蛋白表达下降，凋亡受到抑制，促进了CAG的发生、发展。经莪连颗粒干预后，胃窦组织p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显降低，提示莪连颗粒可抑制CAG大鼠胃窦组织JAK2、STAT3磷酸化，从而抑制JAK2/STAT3通路激活，SOCS3蛋白表达升高，进一步提示JAK2/STAT3通路的抑制，Bcl-2蛋白表达显著降低而Bax蛋白表达显著升高，表明莪连颗粒可通过降低JAK2/STAT3通路下游信号因子Bcl-2/Bax的比值来发挥促凋亡作用。综上，莪连颗粒可能通过调控JAK2/STAT3通路治疗CAG。

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基金资助:国家中医药管理局中医药循证能力建设项目(2019XZZX-XH013);国家中医药管理局国家中医优势专科项目(国中医药医政函[2024]90号,沪卫中管便函[2024]20号);

文章来源:贾庆玲,易志荣,蒋凯林,等.莪连颗粒调控JAK2/STAT3通路治疗慢性萎缩性胃炎的机制[J].上海中医药杂志,2025,59(01):72-79.