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姜黄素对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

2025-01-16 66 上传者：管理员

摘要：目的探讨姜黄素对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)异常增殖和迁移的影响及其作用机制。方法将VSMC分为对照1组，血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)1组，姜黄素1组，姜黄素2组和姜黄素3组(n=11),除对照1组外，其他4组使用AngⅡ建立细胞增殖模型，姜黄素1、2、3组分别给予姜黄素1.5、3.0、4.5μmol/L干预，另取VSMC分为对照2组，AngⅡ2组，姜黄素组和姜黄素+AngⅡ组(n=3)。采用Western blot法检测VSMC分化表型蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、去分化表型蛋白骨桥蛋白(Osteopontin, OPN),自噬相关蛋白(P62、Beclin-1)以及腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin, mTOR)途径相关蛋白AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、p70S6K、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)表达水平。结果 AngⅡ1组VSMC增殖率、迁移率明显高于对照1组(155%vs 100%,66%vs 48%,P<0.05)。与AngⅡ1组比较，姜黄素2、3组VSMC增殖率以及姜黄素1、2、3组VSMC迁移率明显降低(P<0.05)。与AngⅡ1组比较，姜黄素2、3组α-SMA表达明显升高，姜黄素1、2、3组OPN表达明显降低(P<0.05)。与对照2组比较，AngⅡ2组和姜黄素组Beclin-1、p-AMPK/AMPK表达明显升高，P62、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显降低(P<0.05)。与AngⅡ2组比较，姜黄素组和姜黄素+AngⅡ组Beclin-1、p-AMPK/AMPK表达明显升高，P62、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显降低(P<0.05)。结论姜黄素能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖及迁移，其作用机制可能与姜黄素激活AMPK/mTOR信号通路增强VSMC的自噬有关。

关键词：
VSMC
姜黄素
平滑肌
细胞增殖
肌细胞
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目前研究证实，血管内膜增生是造成血液透析血管通路狭窄的主要原因之一，其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的异常增殖、迁移以及表型转化是形成内膜增生的关键环节[1]。自噬作为细胞稳态的关键调节机制，已有证据显示，自噬可参与多种因素引起的VSMC增殖、细胞表型转化、细胞内钙离子浓度调节、炎性反应、脂质沉积等活动，从而参与血管增生性疾病的发生发展[2-6]。因此，血管内膜增生与VSMC的增殖、迁移、表型转化以及自噬之间有着密不可分的关系，有效抑制VSMC的异常增殖及迁移可能是防治血管内膜增生的重要手段。

姜黄素是植物姜黄中的主要活性成分，近年来的研究表明，姜黄素产生抗氧化、抗炎、抗增殖、抗血栓形成等药理特性[7]。许多研究已证实，姜黄素是一种天然的自噬调节剂，能有效抑制VSMC增殖，但具体机制仍有待阐明[8-9]。基于此，本研究采用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导VSMC增殖及迁移，建立细胞增殖模型，旨在探讨姜黄素抗血管内膜增生的可能机制。

1、材料与方法

1.1 细胞与材料

小鼠主动脉VSMC,购自ATCC细胞库。姜黄素、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO),购自美国Sigma; 血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ),购自北京索莱宝；胎牛血清、胰酶、DMEM高糖培养液、青-链霉素，购自美国Gibco; Cell counting kit 8试剂盒，购自日本同仁化学研究所；α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)抗体，购自美国NOVUS;去分化表型蛋白骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)抗体，购自美国R&D Systems; β肌动蛋白(Beta-actin, β-actin)抗体、P62抗体，购自美国Affinity; Beclin-1抗体，购自中国Abmart; AMPK抗体、磷酸化-AMPK抗体、mTOR抗体、磷酸化-mTOR抗体、真核翻译起始因子4E结合蛋白1和p70核糖体蛋白S6激酶(p70ribosomal S6 kinase, p70S6K)抗体、磷酸化-p70S6K抗体，购自美国immunoway; 山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG,购自美国EARTHOX抗体。

1.2 方法

小鼠主动脉VSMC呈梭形，贴壁生长，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养于CO2浓度为5%、温度为37℃的细胞培养箱中，3 d换液1次。

为探讨不同浓度姜黄素对AngⅡ诱导的VSMC增殖及迁移的影响，将VSMC分为对照1组，AngⅡ1组，姜黄素1组，姜黄素2组和姜黄素3组(n=11),除对照1组外，其他4组使用1×10-6mol/L AngⅡ处理48 h[10]。姜黄素1、2、3组分别给予姜黄素1.5、3.0、4.5 μmol/L干预。

为探讨姜黄素对VSMC自噬以及AMPK/mTOR信号通路的影响，将VSMC分为对照2组，AngⅡ2组，姜黄素组和姜黄素+AngⅡ组(n=3)。AngⅡ2组、姜黄素组和姜黄素+AngⅡ组分别给予1×10-6mol/L AngⅡ、3 μmol/L姜黄素、1×10-6mol/L AngⅡ+3 μmol/L姜黄素干预。

1.3 CCK8检测不同浓度姜黄素对VSMC增殖的影响

将对数生长期的VSMC种入96孔板的每孔中，放入培养箱中过夜，细胞贴壁后吸出培养液，用AngⅡ(1×10-6mol/L)处理细胞48 h后，根据实验分组，依次加入(1.5、3、4.5 μmol/L)姜黄素，其中每组包括5个复孔，置于细胞培养箱培养24 h, 培养结束后吸出旧的培养液，于避光条件下向每个复孔加入100 μl DMEM培养液和CCK8液的混合液(配置比10〯1),加液环节避免引入气泡，培养1 h后终止，在酶标仪上测定每孔450 nm处吸光度值。

1.4 划痕试验

将VSMC接种在6孔板中，培养至80%密度，吸出培养液，用AngⅡ(1×10-6mol/L)处理细胞48 h后，用200 μl移液管尖在平板上划出一道笔直划痕，按照实验分组分别处理细胞24 h。24 h后用倒置显微镜拍摄，采用Image J 1.53a版图像处理软件并根据恢复面积百分比分析细胞迁移程度。

1.5 Western blot实验

AngⅡ(1×10-6mol/L)处理细胞48 h并按照实验分组处理细胞24 h后，使用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测配平蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，室温摇床封固1 h, 分别加入鼠抗α-SMA(1〯2000)、鼠抗OPN抗体(1〯2000)、鼠抗Beclin-1抗体(1〯1000)、兔抗P62抗体(1〯1000)、兔抗腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)抗体(1〯1000)、兔抗p-AMPK抗体(1〯1000)、兔抗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammaliantargetofrapamycin, mTOR)抗体(1〯1000)、兔抗p-mTOR抗体(1〯1000)、兔抗p70S6K抗体(1〯1000)、兔抗p-p70S6K(1〯1000),4℃孵育过夜，洗涤后再加入相应的二抗(1〯10 000)室温孵育1 h, 用全自动化学发光成像分析系统行化学发光法检测，以β-actin蛋白表达为内参，结果以靶蛋白/内参的灰度比值表示。

1.6 统计学方法

采用GraphPadPrism 9.0软件进行统计分析，计量资料以

表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 姜黄素抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖

对照1组，AngⅡ1组，姜黄素1、2、3组VSMC增殖率分别为100%、155%、139%、85%、67%。AngⅡ1组VSMC增殖率明显高于对照1组(P<0.05)。与AngⅡ1组比较，姜黄素1组VSMC增殖率略有降低(P>0.05),姜黄素2、3组VSMC增殖率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,图1)。姜黄素1、2、3组VSMC增殖率逐渐下降。

图1不同浓度姜黄素对VSMC增殖的影响

2.2 姜黄素抑制AngⅡ诱导的VSMC迁移

对照1组，AngⅡ1组，姜黄素1、2、3组VSMC迁移率分别为48%、66%、38%、30%、15%。AngⅡ1组VSMC迁移率明显高于对照1组，差异有统计学意义(P<0.05)。与AngⅡ1组比较，姜黄素1、2、3组VSMC迁移率明显降低，有统计学差异(P<0.05,图2)。且姜黄素1、2、3组VSMC迁移率逐渐下降。

图2不同浓度姜黄素对VSMC迁移的影响 ×50

2.3 姜黄素对VSMC表型转化的影响

AngⅡ1组VSMC分化表型蛋白α-SMA表达明显低于对照1组，去分化表型蛋白OPN表达明显高于对照1组(P<0.05)。与AngⅡ1组比较，姜黄素1组α-SMA表达略有升高(P>0.05),姜黄素2、3组α-SMA表达明显升高(P<0.05),姜黄素1、2、3组OPN表达明显降低(P<0.05,表1,图3)。

表1姜黄素对VSMC表型转化相关蛋白表达水平的影响

图3各组表型转化相关蛋白表达

2.4 姜黄素对VSMC自噬水平的影响

与对照2组比较，AngⅡ2组和姜黄素组Beclin-1表达明显升高，P62表达明显降低(P<0.05)。与AngⅡ2组比较，姜黄素组和姜黄素+AngⅡ组Beclin-1表达明显升高，P62表达明显降低(P<0.05,图4,表2)。

图4各组自噬相关蛋白表达

表2姜黄素对VSMC自噬相关蛋白表达水平的影响

2.5 姜黄素对AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的影响

与对照2组比较，AngⅡ2组和姜黄素组p-AMPK/AMPK表达明显升高，p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与AngⅡ2组比较，姜黄素组和姜黄素+AngⅡ组p-AMPK/AMPK表达明显上调，p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05,表3,图5)。

表3姜黄素对VSMC中AMPK/mTOR信号通路表达水平的影响

图5各组AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达

3、讨论

在正常生理状态下，VSMC对于维持血管壁的完整性和生理功能起着重要作用，当受到刺激因子的作用后，可发生表型转化，由分化型转变为去分化型，从而发挥增殖及迁移的能力[11-13]。既往研究发现，在阻塞性血管疾病患者体内AngⅡ水平明显升高，AngⅡ可促使VSMC发生表型转化，进而刺激细胞增殖及迁移[14-15]。故本研究采用AngⅡ诱导VSMC建立细胞增殖模型，通过CCK8实验提示AngⅡ1组VSMC增殖率明显高于对照1组，划痕实验表示AngⅡ1组VSMC迁移率明显高于对照1组，Western blot实验显示AngⅡ1组分化型相关蛋白α-SMA表达明显低于对照1组，去分化型相关蛋白OPN表达明显高于对照1组，差异有统计学意义。

自噬在VSMC的生理和病理过程中起着双重作用，适度自噬对VSMC具有保护作用，过度自噬或自噬缺陷均能导致VSMC的异常增殖及迁移，这表明自噬水平的调控对VSMC的增殖及迁移有着重要的意义[16]。P62作为自噬降解底物，被认为是自噬激活的标志，Beclin1为自噬启动蛋白，其表达强度与自噬活性呈正相关[17]。自噬水平受到许多途径的调控，其中AMPK/mTOR信号通路是调控细胞自噬的重要信号通路，AMPK活化可以抑制mTOR,影响p70S6K磷酸化水平，进而影响细胞生长、增殖和分化等活动[18]。因此，通过介导AMPK/mTOR信号通路调控VSMC自噬水平可能作为抑制VSMC增殖及迁移的治疗靶点。现代药理学表明姜黄素能有效抑制VSMC增殖及迁移，且对细胞自噬水平具有调控作用，但关于其作用机制仍不清楚。

本研究使用不同剂量的姜黄素干预AngⅡ诱导后的VSMC,与AngⅡ1组比较，姜黄素1组VSMC增殖率略有降低，迁移率明显降低，姜黄素2、3组VSMC增殖率和迁移率明显降低，表明姜黄素能有效的抑制VSMC的增殖及迁移，且在中等浓度的姜黄素(3 μmol/ml)作用下，姜黄素能够有效地抑制VSMC增殖及迁移，同时促进自噬，且未观察到明显的细胞毒性。同时，Western blot实验结果表示，姜黄素能抑制AngⅡ诱导VSMC发生的表型转化。Western blot检测自噬标志物及AMPK/mTOR相关蛋白，单用AngⅡ与单用姜黄素干预细胞时，均能促进细胞自噬，激活AMPK/mTOR信号通路，与单用AngⅡ比较，使用姜黄素+AngⅡ联合干预细胞后，对VSMC自噬的促进作用以及对AMPK/mTOR信号通路的激活作用进一步增强。研究发现，AngⅡ和姜黄素均可调控VSMC自噬，AngⅡ在促进VSMC增殖和迁移的同时也激活了自噬，而姜黄素则进一步增强了AngⅡ诱导的自噬来抑制VSMC的增殖和迁移，原因可能是姜黄素通过增强自噬来清除AngⅡ诱导的损伤成分，从而抑制VSMC的异常增殖和迁移。

综上所述，姜黄素可以抑制AngⅡ诱导的VSMC的增殖、迁移以及表型转化，机制上可能与其介导的AMPK/mTOR通路上调自噬有关，本研究为姜黄素应用于血管内膜增生的防治提供了一定的实验依据。

参考文献:

[4]姚艳丽,张春菊,蔡洪信,等.糖基化终产物通过微小rna-30A调控自噬对血管内皮细胞功能的影响[j].中华老年心脑血管病杂志,2022,24(6):643-647.

[10]刘俪婷,熊智倩,姜燕,等.丹参酮ⅱa对血管紧张素ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响[j].中国医科大学学报,2024,53(5):439-445.

基金资助:贵州省卫生健康委科学技术基金项目(GZWKJ2023-143);中国民族医药学会科研项目(2021z1051-451402);中国血液透析血管通路青年医师研究项目(msxm002);

文章来源:苏朝江,刘俪婷,熊智倩,等.姜黄素对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响[j].中华老年心脑血管病杂志,2025,27(01):89-93.