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胆木提取物对哮喘大鼠气道高反应性和炎症的影响

2025-05-08 49 上传者：管理员

摘要：目的:观察胆木提取物对哮喘大鼠气道高反应性和炎症的影响。方法:卵白蛋白反复攻击7 d制备大鼠哮喘模型，实验分正常组、模型组、胆木提取物（100、300、900 mg/kg）组和地塞米松（DXM 2 mg/kg）组，每组8只，各组分别给予相应剂量药物连续灌胃给药10 d。用乙酰甲胆碱（Mch）激发哮喘大鼠的气道高反应性，检测各组大鼠的肺阻力（RL）和动态肺顺应性(Cdyn);取支气管肺泡灌洗液（BALF）检测气道炎症细胞的浸润情况；同时取大鼠肺组织行HE染色，显微镜下观察肺组织嗜酸性粒细胞浸润情况。结果:与正常组比较，模型组大鼠气道反应性明显增高，同时BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞数目显著增加，肺组织嗜酸性粒细胞明显浸润至支气管周围和血管周围。胆木提取物各组呈剂量依赖地抑制大鼠的气道高反应性，降低BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞数目，减轻肺组织嗜酸性粒细胞浸润。结论:胆木提取物对大鼠支气管哮喘有防治作用，为其应用于哮喘的治疗提供了实验依据。

关键词：
哮喘
气道高反应性
炎症反应
病理学
胆木提取物
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胆木由茜草科植物乌檀的枝､树皮､叶制成,是一种珍贵的中药药材｡胆木主要分布于我国海南､广西､湖南和广东等地｡胆木味苦,性寒,具有清热解毒､消肿止痛功效｡胆木提取物的主要化学成分为生物碱类,具有抗炎作用[1]｡目前,临床上胆木提取物常用于治疗上呼吸道感染,对哮喘也有一定的治疗效果[2],但是对其具体作用和机制的研究不多｡

为了进一步研究胆木提取物抗哮喘作用和机理,本文建立了卵白蛋白致敏的大鼠哮喘模型,通过对气道炎症细胞的数目和致敏大鼠肺阻力和肺顺应性的改变观察胆木提取物对哮喘的作用｡

1、实验材料

1.1药物

胆木叶由浙江震元股份有限公司提供,经绍兴市食品药品检验研究院鉴定为正品｡根据曹亮等[3]采用的办法提取胆木提取物:胆木叶切成大小适中的碎片,用60%的乙醇提取2次,过滤后,用NaOH溶液调整pH至8.5;用HPD-100大孔树脂纯化,梯度乙醇洗脱并浓缩干燥得胆木提取物颗粒｡胆木提取物颗粒得率约1.5%,备用｡地塞米松(2g/L):浙江震元股份有限公司｡

1.2实验动物

健康成年SD大鼠,清洁级,雌雄各半,共48只;其中雄性体质量(224±11)g,雌性体质量(197±13)g;购于浙江省医学科学院实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(浙)2014-001｡实验动物饲养于绍兴文理学院动物实验中心,温度(22±2)℃,湿度(60±5)%,安静环境下饲养｡

1.3主要试剂

乙酰甲胆碱(Mch):美国Sigma公司;卵白蛋白(OVA):美国Sigma公司;肝素:浙江医药有限公司｡

1.4主要仪器

TurboBOYN雾化吸入器:德国百瑞公司;5030R高速冷冻离心机:德国Eppendorf公司;BX53M正置显微镜:日本Olympus公司;MedLad生物信号采集系统:南京卡尔文生物公司;YP200压力换能器:上海益联医学仪器发展有限公司｡

2、方法

2.1大鼠哮喘模型制备和实验分组

哮喘模型制作方法采用孙建刚等[4]采用的哮喘动物造模方法｡大鼠用乙醚麻醉后,用2%OVA(佐剂为10%氢氧化铝凝胶)混合液皮下注射致敏,共注射10点,总计1mL/只;正常对照组用10%的氢氧化铝凝胶皮下注射致敏｡实验共分6组:正常对照组､模型组､胆木提取物低剂量(100mg/kg)组､胆木提取物中剂量(300mg/kg)组､胆木提取物高剂量(900mg/kg)组､地塞米松(2mg/kg)组,每组8只,雌雄各半｡大鼠皮下多点注射致敏后第11天,模型组和正常组按体质量予生理盐水灌胃,其他组开始按相应剂量灌胃给药,连续给药10d｡从第15天起每天上午以1%OVA溶液用超声雾化仪雾化后,大鼠被动吸入,每次用时25min,连续7d用于激发哮喘[5-6]｡

2.2观察指标

2.2.1气道反应性测定

大鼠哮喘模型成模后,0.3%水合氯醛腹腔注射麻醉(50mg/kg),切开大鼠颈部皮肤,用头皮留置针穿刺大鼠颈静脉,同时分离出气管,进行气管插管,将大鼠置于密闭的容积描记器中,待大鼠呼吸稳定后,将Mch溶液按照剂量从低到高通过颈静脉注射给药,Mch浓度分别为0.125､0.25､0.5､1.0､2.0μg/kg,每一Mch浓度给药后,需间隔10min后再进行下一个浓度激发;用Medlab生物信号采集系统记录大鼠在Mch静脉注射前后其气道流速､潮气量､跨肺压的变化,用跨肺压与呼吸气道流速的比值计算气道阻力(RL,cmH2O/s·mL),用平均潮气量与平均跨肺压的比值计算肺顺应性(Cdyn,mL/cmH2O)[5-6]｡

2.2.2支气管肺泡灌洗液白细胞和分类计数

大鼠完成肺阻力和肺顺应性测定后,剪断大鼠右侧股动脉,放血处死,分3次在大鼠气管内灌注D-Hank’S液,每次用量5mL,反复冲洗,每次回收支气管肺泡灌洗液｡取少量支气管肺泡灌洗液,显微镜下用细胞计数板计数白细胞总数,剩余支气管肺泡灌洗液2500r/min离心10min,取2μL沉淀涂片,Wright染色,显微镜下记录白细胞分类计数｡

2.2.3肺组织病理观察

完整收集抗原激发后各组大鼠肺脏,置入10%福尔马林溶液的容器中固定｡固定后,肺纵向切片,包括气管､气道以及左右肺｡将肺组织石蜡包埋并切片,厚度为5(m,然后进行HE染色,显微镜下观察肺嗜酸性粒细胞浸润情况,重点观察小气道周边､血管周边情况｡

2.3统计方法

实验数据均以平均值±标准差(x±s)表示,用SPSS17.0统计软件进行统计;若数据方差齐性多组间比较用单因素方差分析,两组间比较用LSD检验,若方差不齐,采用Dunnett’sT3检验;P<0.05表示有统计学意义｡

3、结果

3.1胆木提取物对哮喘大鼠气道高反应的影响

与正常组相比,模型组在各Mch浓度下气道阻力(RL)明显增加(P<0.01),肺顺应性(Cdyn)明显降低(P<0.01)｡胆木提取物能抑制大鼠气道阻力增加和肺顺应性降低,并且呈剂量相关性｡与模型组相比,胆木提取物低剂量组气道阻力和肺顺应性只在Mch2μg/kg有差异(P<0.05),其余Mch剂量无明显差异;胆木提取物中剂量组气道阻力在Mch1μg/kg有差异(P<0.05),在Mch2μg/kg有显著差异(P<0.01),肺顺应性在Mch1μg/kg和2μg/kg均有差异(P<0.05);胆木提取物高剂量组气道阻力在Mch0.25μg/kg即有差异(P<0.05),Mch0.5､1､2μg/kg均有显著差异(P<0.01);肺顺应性在Mch1μg/kg和2μg/kg均有差异(P<0.05),见图1~图2｡

图1各组大鼠气道阻力变化比较(动物数:8只)｡

图2各组大鼠肺顺应性变化比较(动物数:8只)

3.2胆木提取物对哮喘大鼠BALF白细胞及分计数的影响见表1｡

3.3胆木提取物对哮喘大鼠肺组织嗜酸性粒细胞浸润的影响

正常组大鼠肺组织没有表现出异常的组织学炎症表现｡模型组大鼠肺组织嗜酸性粒细胞明显浸润到支气管周围和血管周围,可见大片嗜酸性粒细胞聚集,呈放射状排列｡胆木提取物低剂量组大鼠肺组织内可见类似模型组的肺组织炎症表现,胆木提取物中剂量组和高剂量组嗜酸性粒细胞浸润程度明显减轻,地塞米松组大鼠肺组织病理与正常组相似｡见图3｡

表1各组大鼠BALF白细胞及分类计数比较(x±s,107个/L)

图3各组大鼠肺组织嗜酸性粒细胞浸润的病理观察(HE,×400)

4、讨论

哮喘是气道慢性炎性疾病,发病机制非常复杂,涉及多种炎症细胞及相关细胞因子[7]｡哮喘的气道高反应与气道炎症有关,各类炎症相关细胞如嗜酸性粒细胞､T淋巴细胞､肥大细胞等均参与哮喘的发生,其中嗜酸性粒细胞及其相关细胞因子与哮喘的严重程度及气道高反应性紧密相关[5,8]｡因此,常用嗜酸性粒细胞数目和气道高反应性来评价哮喘严重程度,为临床提供重要的参考价值[9-10]｡目前临床上治疗哮喘药物品种较多,但是最经典有效的药物为糖皮质激素,糖皮质激素能明显抑制哮喘的炎症反应,同时能减少气道阻力和增加肺顺应性,但糖皮质激素治疗副作用明显[11-12]｡中医药由于其副作用轻,已经成为药物开发的新热点｡

本研究中,SD大鼠经卵白蛋白致敏并接受雾化的卵白蛋白气道攻击后,成功复制哮喘模型｡哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞特别是嗜酸性粒细胞数目明显增加,气道反应明显增高,肺组织内嗜酸性粒细胞聚集,表明哮喘模型制作成功｡

哮喘病变机制包括气道嗜酸性粒细胞浸润,气道炎症改变并损伤气道,气道平滑肌痉挛引起的气道高反应性[7,10]｡气道高反应性和气道炎症能较好地反应哮喘的严重程度,适宜作为评价指标[13]｡本研究选用气道阻力和肺顺应性变化来客观观察气道功能状况;通过支气管肺泡灌洗液中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数变化,大鼠肺组织病理嗜酸性粒细胞浸润来评价气道炎症变化情况｡结果可见:胆木提取物能明显减轻哮喘大鼠经乙酰甲胆碱刺激后引起的气道阻力增大,明显抑制哮喘大鼠经乙酰甲胆碱刺激后引起的肺顺应性降低｡

支气管哮喘涉及多种细胞及细胞因子,其中起到关键作用是嗜酸性粒细胞,特别是在哮喘迟发反应中[14-15]｡本研究结果显示,胆木提取物能明显减少哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液中的白细胞计数和嗜酸性粒细胞数,也能减轻哮喘大鼠气道周边和血管周边嗜酸性粒细胞的浸润;提示胆木提取物能够有效抑制哮喘的气道炎症反应｡

综上,胆木提取物能改善哮喘气道阻力和增加肺顺应性,减少炎性细胞浸润,为其进行临床应用提供理论依据｡

参考文献:

[1]王月,廖锦红,孙立新.胆木及其制剂研究进展[J].亚太传统医药,2018,14(8):80-84.

[2]蔡兴俊,黄奕江,郑亚妹.胆木提取物对哮喘小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞及细胞因子的影响[J].中国热带医学,2018,18(5):427-429.

[3]曹亮,李娜,姜雅琼,等.胆木叶提取部位群的抗炎镇痛作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(24):124-127.

[5]周琴,孙建刚.氧化苦参碱对致敏小鼠气道高反应性和炎症的影响[J].中药药理与临床,2009,25(1):21-23.

[6]汤慧芳,陈季强,谢强敏,等.隐孔菌多糖成分对致敏大鼠气道高反应性和炎症细胞的影响[J].浙江大学学报(医学版),2003,32(4):287-291.

基金资助:浙江省中医药科技计划项目(2023ZL728);越医人才项目(绍市中医[2021]91号); 浙江省绍兴市卫生健康科技计划项目(2024SKY061);

文章来源:孙建刚,周琴,朱文瑞.胆木提取物对哮喘大鼠气道高反应性和炎症的影响[J].中国中医药科技,2025,32(03):420-424.