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运用高速逆流色谱技术规模化制备灵芝酮三醇

2020-06-17 169 上传者：管理员

摘要：以沪农灵芝1号子实体为原料,经过87%乙醇提取、D101大孔树脂富集、乙醇梯度洗脱获得弱极性三萜组分。采用高速逆流色谱技术,以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(V∶V∶V∶V=5∶6∶5∶5)为溶剂体系,对该三萜组分中灵芝酮三醇的制备工艺进行研究,在转速900r•min-1、流速3mL•min-1条件下,一次上样400mg灵芝弱极性三萜组分,可得到纯度为91.6%的灵芝酮三醇26.8mg。

关键词：
中药学
大孔树脂
弱极性三萜
灵芝子实体
规模化
高速逆流色谱
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灵芝作为一种传统的药用真菌,近年来受到国内外研究者的广泛关注。三萜是灵芝中的主要活性成分之一,具有抑制肿瘤细胞生长、抗氧化、调节免疫、降血糖、降血脂、抗病毒、抗菌、消炎、保肝、护肝等功效[1,2]。灵芝子实体中成分复杂,三萜化合物种类繁多,分离纯化十分困难。目前,灵芝三萜标准品主要通过硅胶柱层析、高效液相色谱法制备,这类方法耗时耗材,需要反复上样洗脱,不适合规模化制备。高速逆流色谱(HSCCC)是一种基于液液分配萃取的分离技术,与传统的柱色谱法相比,具有预处理简单、上样量大、分离时间短、无样品残留与吸附等优点,被广泛应用于中药材化合物的分离制备[3]。目前,已实现了应用高速逆流色谱法对灵芝三萜的分离。朱忠敏等[4]应用大孔树脂结合高速逆流色谱,从灵芝子实体中分离得到灵芝酸F、C1、A、C2。CHENG等[5]直接采用逆流色谱法从灵芝粗提物中分离得到灵芝酸C6、E、F,再应用高速逆流色谱结合ph-区带精制逆流色谱法分离得到了灵芝酸G、A、B、D和灵芝烯酸D。FENG等[6]和岳亚文等[7]应用高速逆流色谱法从灵芝中制备出灵芝酸S、灵芝酸T、灵芝烯酸B和灵芝醇B。

灵芝酮三醇自从1986年被发现以来[8],大量药理实验已经证明其具有抗HIV-1蛋白酶、抑制HIV-1对MT-4细胞的侵袭、抗前列腺LNCaP肿瘤细胞、保肝等功效[9,10,11,12]。XU等[13]发现灵芝酮三醇可抑制人肝癌相关基因的表达。JEDINAK等[14]发现灵芝酮三醇可以抑制HCT-116和HT-29结肠癌细胞的增殖。因此,灵芝酮三醇作为一种具有潜在抗癌活性的化合物,具有巨大的应用前景。目前该化合物主要通过硅胶柱层析分离制备[15,16,17],这种分离方式时间长、效率低、获得的目标化合物量少,制约了对灵芝酮三醇的深入研究和有效开发应用。本研究获得了一种应用高速逆流色谱技术从灵芝子实体中制备灵芝酮三醇的方法,实现了灵芝酮三醇的规模化制备,为该化合物进一步的体内作用机制研究提供了物质基础。

1、材料与方法

1.1材料、试剂

沪农灵芝1号子实体购自浙江省龙泉市。

D-101大孔树脂(食品级)购自天津海光化工有限公司;标准品(灵芝酸C2、灵芝酸DM、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酸S、灵芝酸T、灵芝酮三醇、灵芝醇B,纯度≥98%)购自国家标准物质标准样品信息中心;95%乙醇(食用级)购自太仓新太酒精有限公司;95%乙醇(工业级)购自上海振兴化工一厂;甲醇、乙酸乙酯、正己烷、冰醋酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;乙腈(色谱级)购自北京迪科马科技有限公司;氘代氯仿购自美国CambridgeIsotopeLaboratories公司。

1.2主要仪器

BüchiVacV-500旋转蒸发仪(瑞士Büchi公司);HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒试验仪器有限公司);2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);AL204电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);KQ-600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TBE-300B高速逆流色谱仪(上海同田生物技术股份有限公司);ELGA超纯水仪(法国Veolia公司);VarianInova-500型核磁共振仪(美国Varian公司);1100LC/MSDSL质谱仪(美国Agilent公司);2000L中试提取罐(江苏天宇机械有限公司);XF-250树脂柱(70L,天津隆业轻工机械有限公司)。

1.3弱极性三萜组分的制备

取50kg沪农1号灵芝子实体切片(厚度3mm),置于中试提取罐中,加入8倍体积的87%乙醇,65℃提取2次,第一次2h,第二次1h,合并提取液,浓缩获得提取物(TTF)。将提取物复溶于10L50%乙醇得到混悬液,过D101大孔树脂层析柱,用50%～95%乙醇溶液依次梯度洗脱。对95%乙醇洗脱液减压浓缩,得到弱极性三萜组分(WTF)204.4g。

1.4HPLC分析

分别取1mg灵芝弱极性三萜组分(WTF)、灵芝子实体87%乙醇提取物(TTF)、三萜标准品溶于1mL甲醇中,20μm有机滤膜过滤后用HPLC分析。色谱柱为AgilentZORBAXSB-Aq(4.6mm×250mm,5μm);流动相A为乙腈,B为0.01%冰醋酸;梯度洗脱(0～20min:28%～32%A;20～50min:32%～39%A;50～60min:39%～60%A;60～85min:60%～100%A;85～100min:100%A);进样量10μL;柱温30℃;检测波长244nm。

1.5HSCCC溶剂体系的筛选

由于制备获得的三萜组分为弱极性物质,因此,选择弱极性和中等极性的溶剂体系进行研究,其中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系相对环保,适合规模化使用,因此,该体系被用来筛选分离灵芝三萜的最佳溶剂体系。

参考文献[18]的方法考察目标化合物在不同体积比溶剂下的分配系数(K值)。取1mg样品(WTF)置于10mL试管中,用预先平衡好的溶剂体系(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的体积比分别为5∶5∶6∶1、5∶5∶6∶4、5∶5∶6∶5、5∶5∶7∶5、5∶5∶8∶5、5∶7∶5∶5、5∶6∶5∶5、4∶8∶5∶5、5∶8∶5∶5、6∶8∶5∶5),分别取2mL的上相和下相将其溶解,剧烈震荡使其充分混合分层,平衡后分别取1mL上相和下相,置于真空离心浓缩仪中浓缩,再用1mL甲醇复溶,用HPLC分别测定上相和下相中目标化合物的峰面积(分别记作A上和A下),分配系数K=A上/A下[19]。选择K值合适的溶剂体系进行下一步实验。

1.6高速逆流色谱分离灵芝酮三醇的工艺优化

流速的选择:分别选取2、3、4mL·min-1为流动相流速,转速900r·min-1,柱温25℃,上样量200mg,分别做高速逆流实验,计算目标化合物的得率,分离所得样品用HPLC检测,检测条件同1.4,采用面积归一法测定目标化合物的纯度,选择最佳流速。

转速的选择:分别选取700、800、900r·min-1作为转速,使用上述最佳流速,柱温25℃,上样量200mg,分别做高速逆流实验,计算目标化合物的得率和纯度,选择最佳转速。

上样量的选择:分别选取200、300、400mg作为上样量,使用上述最佳流速和转速,柱温25℃,分别做高速逆流实验,计算目标化合物的得率和纯度。

采用最佳流速、转速和上样量,进行验证实验。

1.7结构鉴定

利用VarianInova-500型核磁共振仪对化合物的1H-NMR和13C-NMR谱进行测定。核磁共振及APCI-MS测定均委托中国科学院有机化学研究所完成,根据核磁和质谱数据鉴定化合物的化学结构。

2、结果与分析

2.1弱极性三萜组分(WTF)的HPLC分析结果

灵芝弱极性三萜组分、灵芝子实体87%乙醇提取物和8个标准品的高效液相色谱图见图1。灵芝子实体87%乙醇提取物上D101大孔树脂,用95%乙醇洗脱,可以有效富集弱极性的三萜组分(出峰时间在70～85min之间的峰)。与灵芝三萜标准品对比后,利用高速逆流色谱技术对弱极性三萜组分中响应值较高的灵芝酮三醇(标准品中4号峰对应的峰)这一化合物进行制备。

图1弱极性三萜组分、87%乙醇提取物、标准品的HPLC色谱图

2.2HSCCC溶剂体系的筛选结果

由表1可知,溶剂体系正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶5∶6∶4、5∶5∶6∶5、5∶5∶7∶5、5∶7∶5∶5、5∶6∶5∶5的K值在0.5～5之间,根据Ito理论[19],这些体系均在适合的范围内。K值过大意味着更长的分离时间,耗费更多的试剂,而K值过小则意味着出峰时间很快,目标化合物分离度差,纯度较低。综合考量试剂、时间成本以及获得目标化合物的纯度和得率,最终选择正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=5∶6∶5∶5作为分离目标化合物的溶剂体系。

表1灵芝酮三醇在不同体积比的溶剂体系中的分配系数

2.3利用HSCCC分离灵芝酮三醇的工艺优化

不同流速下高速逆流色谱分离的灵芝酮三醇的得率和纯度见表2。在2mL·min-1和3mL·min-1时,灵芝酮三醇的得率和纯度相差不大,流速为4mL·min-1时,虽然纯度变化不大,但得率明显降低。3.0mL·min-1流速时,灵芝酮三醇的保留时间小于2.0mL·min-1流速的,因此,选择3.0mL·min-1作为分离灵芝酮三醇的最适流速。

表2不同流速对灵芝酮三醇得率和纯度的影响

由表3可知,在不同转速下都可实现对灵芝酮三醇的有效分离,且随着转速的提高,灵芝酮三醇的得率和纯度逐渐上升,因此,选择900r·min-1为最佳转速。

由表4可知,随着上样量的增大,灵芝酮三醇的得率变化不大,但上样量为400mg时,获得的样品纯度高于其他处理。由于上样量大于400mg时,样品不能完全溶解,因此确定每次400mg作为最大和最佳上样量。

2.4制备工艺中试实验

采用上述筛选出的分离制备条件,暨溶剂体系正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(V∶V∶V∶V=5∶6∶5∶5),流速3.0mL·min-1,转速900r·min-1,上样量400mg,柱温25℃(室温),进行验证实验,制备出的样品经HPLC分析,在该条件下,可一次从400mg灵芝弱极性三萜组分中分离得到纯度为91.6%的灵芝酮三醇26.8mg(图2、3)。

表3不同转速对灵芝酮三醇得率和纯度的影响

表4不同上样量对灵芝酮三醇得率和纯度的影响

2.5结构鉴定

制备的灵芝酮三醇为白色无定形粉末。质谱检测到其正离子APCI-MSm/z:455[M-H2O+H]+,确定该化合物分子式为C30H48O4。其1H-NMR和13C-NMR的数据如下:1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ:5.55(1H,d,J=6.5Hz,H-11),5.46(1H,d,J=6.0Hz,H-7),3.55(1H,d,J=11.0Hz,H-26),3.44(1H,d,J=11.0Hz,H-26),3.37(1H,d,J=9.5Hz,H-24),2.85(1H,m,H-2),1.23(3H,s,H-29),1.13(3H,s,H-28),1.08(3H,s,H-19),1.06(3H,s,H-21),0.94(3H,d,J=5.5Hz,H-30),0.91(3H,s,H-18)。13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:38.2(C-1),36.1(C-2),219.4(C-3),48.8(C-4),51.8(C-5),25.0(C-6),121.5(C-7),144.6(C-8),146.3(C-9),9.4(C-10),118.9(C-11),38.8(C-12),45.2(C-13),52.7(C-14),29.0(C-15),35.0(C-16),52.7(C-17),16.7(C-18),23.2(C-19),38.3(C-20),19.2(C-21),32.9(C-22),29.2(C-23),77.6(C-24),75.7(C-25),69.3(C-26),22.7(C-27),26.3(C-28),19.5(C-29),26.2(C-30)。通过与文献[20]对比1H-NMR和13C-NMR数据后,确定该化合物为灵芝酮三醇(ganodermanontriol),结构式见图4。

图2制备灵芝酮三醇的高速逆流色谱图

图3灵芝酮三醇的HPLC色图谱

图4灵芝酮三醇的结构式

3、小结

本实验采用高速逆流色谱技术从灵芝子实体中分离灵芝酮三醇,对分离体系的K值进行考察,选择正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(V∶V∶V∶V=5∶6∶5∶5)为最佳溶剂体系,采用单因素法对利用HSCCC技术制备灵芝酮三醇的流速、转速和上样量进行优化,最终确定最佳流速为3.0mL·min-1,转速为900r·min-1,上样量为400mg,在该条件下,制备得到的灵芝酮三醇纯度为91.6%,得率为6.7%。该方法简单、快速,适合灵芝酮三醇的规模化制备。

灵芝酮三醇作为一种弱极性三萜化合物,被证实具有良好的药理活性,但目前已有的研究都是在细胞水平上进行,为了深入开展灵芝酮三醇的活性研究,必须大量的获得该化合物。本研究提供了一种分离制备灵芝酮三醇的新方法,相对于硅胶柱层析,本方法采用了毒性小的有机试剂,且分离时间短,可规模化制备,为灵芝酮三醇的开发利用提供了新的途径。

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