首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > 橙皮苷对脓毒症所致急性肾损伤大鼠肾脏的保护作用及其机制研究

橙皮苷对脓毒症所致急性肾损伤大鼠肾脏的保护作用及其机制研究

2020-09-01 163 上传者：管理员

摘要：目的探讨橙皮苷对脓毒症所致急性肾损伤（AKI）大鼠肾脏的保护作用及其机制。方法取28只SD雄性大鼠，采用盲肠结扎和穿刺法建立脓毒症大鼠模型，从建模成功的20只大鼠中抽取18只随机均分为模型组、低剂量（橙皮苷25 mg·kg-1）组、高剂量（橙皮苷50 mg·kg-1）组，另取6只大鼠设为对照组。术后24 h，模型组、低剂量组和高剂量组分别给予生理盐水和对应剂量的橙皮苷腹腔注射，每日1次，共2 d。检测各组肾功能、肾组织细胞凋亡情况，评估肾脏病理损伤评分。检测肾组织炎症因子表达水平和氧化应激指标，Western blotting法检测肾组织Bcl-2、Bax、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达水平。结果与对照组比较，模型组肾脏病理损伤评分、血清尿素氮和肌酐水平，肾脏细胞凋亡指数、Bax和NF-κB蛋白表达水平，肾组织白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达水平，丙二醛（MDA）含量均增高，差异均有显著意义（P <0.05）；与模型组相比，高剂量组和低剂量组前述指标均降低（P <0.05），且高剂量组指标均低于低剂量组（P <0.05）。与对照组比较，模型组肾组织Bcl-2蛋白表达水平、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性降低，差异均有显著意义（P <0.05）；与模型组相比，高剂量组和低剂量组前述指标均升高，且高剂量组高于低剂量组（P <0.05）。结论橙皮苷对脓毒症所致AKI大鼠肾脏有一定的保护作用，降低炎症因子水平、抑制氧化应激和凋亡可能是其作用机制。

关键词：
急性肾损伤
橙皮苷
氧化应激
炎症
细胞凋亡
脓毒症
加入收藏

脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶。据报道，全球每年脓毒症患者超过1 900万例，其中600万人死亡[1]。脓毒症与多器官功能衰竭密切相关，急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是脓毒症常见的致死性并发症。临床上大约50%的AKI由脓毒症引起，患者的病死率可达50%～70%[2]。脓毒症导致AKI的发病机制十分复杂，可能与炎症因子的升高、氧化应激和细胞凋亡有关[3,4]。有学者提出，通过抑制凋亡、改善免疫炎症和氧化应激损伤有助于预防脓毒症导致AKI[5]。橙皮苷（hesperidin）是从芸香科柑橘属植物果实中提取出来的二氢黄酮类化合物，具有抗菌、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、调节血糖和血脂等多种生物学活性[6]。HANEDAN等[7]发现，橙皮苷可以通过抗炎和抗氧化应激损伤而改善黏菌素导致的肾黏膜损伤。CHEN等[8]发现，橙皮苷可以改善顺铂诱导的AKI，这些均提示橙皮苷对肾脏具有保护作用。本研究观察橙皮苷对脓毒症所致AKI的疗效，并探讨其对脓毒症大鼠肾脏炎症因子、细胞凋亡和氧化应激损伤的作用，旨在为橙皮苷治疗脓毒症所致AKI提供理论基础。

材料与方法

动物和建模

SPF级雄性SD大鼠34只，周龄（6.3±0.2）周，体重（303.3±21.1)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2006～2009。饲养在温度（22±2）℃、湿度（50±10）%明暗周期12 h/12 h的环境中，允许自由摄食和饮水。

取28只大鼠采用盲肠结扎和穿刺法（CLP）建立脓毒症大鼠模型[9]。2%戊巴比妥腹腔注射（20 mg·kg-1）麻醉，取腹部正中切口，长度约2 cm，逐层打开腹膜，找到盲肠后游离其远端，将盲肠内粪便挤向远端，用3号丝线结扎盲肠中段并用12号针头在盲肠远端穿孔2次，挤压少许粪便于盲肠表面，然后将盲肠回纳，缝合腹膜、关闭腹腔，术后单笼饲养。24 h后若大鼠出现发热（肛温>正常参考值1℃）、心率加快（超过正常参考值的2倍）、呼吸频率加快（超过正常参考值的2倍），提示大鼠出现脓毒症症状。

试剂和仪器

橙皮苷（纯度98%，长沙上禾生物科技有限公司），TUNEL凋亡检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），白细胞介素（IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α的ELISA检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），Bax、Bcl-2和核因子-κB(NF-κB）抗体（美国Sigma公司），丙二醛（MDA）检测试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（上海盛兆生物科技有限公司）。AU680全自动生化仪（美国贝克曼公司）、CKX53倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）、Image QuantTM LAS4000成像系统（美国GE公司）、ELX808酶标仪（美国Biotek公司）。分组和给药共20只大鼠建模成功，抽取18只随机均分为模型组、低剂量组（橙皮苷25 mg·kg-1组）、高剂量组（橙皮苷50 mg·kg-1），另取6只健康SD大鼠设为对照组。术后24 h，给予模型组、低剂量组和高剂量组大鼠生理盐水、橙皮苷25和50 mg·kg-1腹腔注射，对照组给予等体积生理盐水，每日1次。观察指标给药2 d后，先用眼球采血法采血，再用颈椎脱臼法处死大鼠。取每只大鼠右侧肾脏作为标本，用冷生理盐水冲洗，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成5μm切片。另取肾脏组织，制备组织匀浆。

1.肾功能和肾损伤情况

采用全自动生化检测仪检测大鼠血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。肾组织切片用HE染色，在光学显微镜下放大200倍拍照。采用改良Rabb法[10]对肾损伤进行评价，损伤包括肾小球皱褶、肾小囊扩张、肾小球上皮细胞坏死等12种形态学变化。病理损伤评价标准：无病变（0分），损伤范围<5%(1分），损伤范围5%～25%(2分），损伤范围>25%～75%(3分），损伤范围>75%(4分）。

2.细胞凋亡情况

采用TUNEL法检测肾组织细胞凋亡情况。肾组织切片二甲苯清洗2次，梯度乙醇浸洗1次后，加入20μg·mL-1蛋白酶K处理20 min，蒸馏水洗涤后色缸中加入含20%过氧化氢的PBS。待玻片干燥后，加TUNEL反应混合液50μL，反应1 h后加入终止液。DAB底物50μL反应15 min后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。显微镜观察组织细胞凋亡情况，计算凋亡指数，即每张TUNEL阳性切片取5个高倍视野，计算500个细胞中阳性细胞所占的百分比。

采用Western blotting法检测Bcl-2和Bax蛋白表达水平。肾组织匀浆离心后取上清液，细胞悬液中加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min后离心15 min，将上清液转移至EP管中。样品中加入SDS缓冲液煮沸5 min使蛋白变性。经凝胶电泳（SDS-PAGE）后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗孵育，4℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加二抗室温孵育2 h,TBST洗膜3次，每次5 min。ECL显色，分别以β-actin作为内参。

3.炎症相关指标水平

肾组织匀浆离心后取上清液，用ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，检测时酶标仪波长设置为450 nm。采用Western blotting法检测NF-κB蛋白表达水平，方法同上，以Histone H3作为内参。

4.氧化应激指标

肾组织匀浆离心后取上清液，用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，黄嘌呤氧化酶法检测MnSOD活性，比色法检测GSH-Px活性，检测步骤严格按照试剂盒操作说明书进行。

统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法，P<0.05为差异有显著意义。

结果

肾脏病理性损伤和功能

与对照组比较，模型组肾脏病理损伤评分、血清BUN和Cr水平均增高（P<0.05）。与模型组比较，低、高剂量组病理损伤评分和血清BUN和Cr水平均下降（P<0.05），高剂量组降低更明显，见图1和表1。

图1各组大鼠肾组织病理形态学变化（HE染色，×200)

肾脏细胞凋亡情况

模型组凋亡指数高于对照组（P<0.05），低、高剂量组凋亡指数较模型组降低（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组（P<0.05）。见图2、表1。模型组肾组织Bax蛋白表达水平较对照组高，而Bcl-2较低（P<0.05）；低、高剂量组Bax蛋白表达水平较模型组低，Bcl-2较模型组高（P<0.05）；高剂量组Bax蛋白表达水平低于低剂量组，Bcl-2水平高于低剂量组（P<0.05）。见图3、表1。

图2各组大鼠肾脏细胞凋亡情况（TUNEL染色，×400)

表1各组各项指标比较

图3 Western blotting法检测各组大鼠肾组织Bax和Bcl-2蛋白表达水平

肾脏炎症因子表达水平

模型组肾组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均高于对照组（P<0.05），低、高剂量组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均低于模型组（P<0.05），且高剂量组水平低于低剂量组（P<0.05）。见表1。

肾脏氧化应激指标

与对照组比较，模型组MnSOD、GSH-Px表达水平降低，而MDA水平增高（P<0.05）。与模型组比较，低、高剂量组MnSOD、GSH-Px表达水平增高，MDA水平降低（P<0.05）；且高剂量组MnSOD、GSH-Px表达水平高于低剂量组，MDA水平低于低剂量组（P<0.05）。见表1。

肾脏NF-κB表达水平

与对照组比较，模型组的NF-κB表达水平增高（P<0.05）。与模型组比较，低、高剂量组的NF-κB表达水平均降低，且高剂量组水平低于低剂量组（P<0.05），见图4和表1。

图4 Western blotting法检测各组大鼠肾组织核因子-κB的蛋白表达水平

讨论

ROTIMI等[11]的研究提示橙皮苷可预防脂多糖诱导的大鼠内毒素血症。YUAN等[12]的研究发现橙皮苷可通过抑制Hsp70/TLR4/MyD88信号通路而改善脓毒症所致肺损伤。VASCO等[13]采用CLP法建立了脓毒症大鼠模型，发现橙皮苷可改善脓毒症大鼠肾功能，并减少氧化代谢产物的排泄。本研究中，模型组肾脏病理损伤评分、血清BUN和Cr水平较对照组明显增高，提示造模成功。而橙皮苷低、高剂量组前述指标均明显低于模型组，提示橙皮素干预可以改善脓毒症所致肾脏病理和肾功能损伤，对肾脏有一定的保护作用。

细胞凋亡特别是肾小管上皮细胞凋亡，在脓毒症所致AKI中起到关键作用，脓毒症可能通过线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激等导致肾脏细胞凋亡[14]脓毒症可导致机体全身免疫炎症反应和氧化应激损伤，炎症和氧化应激可损伤肾小球和肾小管，导致肾脏损伤，最终引起肾功能不全[15]。IL-6、TNF-α等炎症因子和SOD等氧化应激指标可作为脓毒症所致AKI的早期诊断标志物，并且这些标志物对判断疾病的预后具有重要价值[16]。较多研究显示，通过抑制炎症因子和氧化应激有助于改善脓毒症所致AKI[17,18,19]。NF-κB是核转录因子，参与炎症反应、氧化应激和凋亡[20,21,22]。有研究发现脓毒症所致AKI大鼠肾组织中NF-κB表达水平升高，当NF-κB从细胞质移位至细胞核，可激活下游的炎症因子IL-6、TNF-α和氧化应激指标SOD等，从而促进炎症反应和氧化应激损伤的加剧，使肾脏损伤加重，而表面活性蛋白D可通过抑制NF-κB进而抑制肾脏细胞凋亡、改善炎症损伤，进而缓解脓毒症所致AKI病情[23]。本研究结果显示，橙皮苷低、高剂量组Bax和NF-κB蛋白表达水平，IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平及MDA含量均较模型组降低，Bcl-2蛋白表达水平、MnSOD和GSH-Px活性较模型组增高，提示橙皮苷可能通过抑制NF-κB激活，进一步抑制下游的炎症和氧化应激反应，减轻细胞凋亡，这可能是橙皮苷治疗脓毒症所致AKI的潜在机制，但需要进行更深入的机制研究。

综上所述，本研究发现橙皮苷对脓毒症所致AKI大鼠肾脏有一定的保护作用，可能与抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡有关。但本研究观察时间较短，且未观察橙皮苷的毒性作用，橙皮苷对脓毒症所致AKI的长期影响、安全性及其确切作用机制有待进一步探讨。

参考文献：

[1]中国医师协会急症医师分会,中国研究型医院学会休克与脓毒症专业委员会.中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)[J].临床急诊杂志,2018,19(9):567-588.

[6]张保顺.橙皮苷衍生物的合成及其药理作用的研究[D].重庆:西南大学,2011.

[16]高友光,林献忠,曾振华,等.虎杖苷对脓毒症急性肾损伤大鼠炎症反应和氧化应激的影响[J].临床麻醉学杂志,2017,33(6):584-587.

[23]梁景云,伍松姣,徐文丽,等.表面活性蛋白D缓解脓毒症诱发的急性肾损伤的机制[J].实用医学杂志,2018,34(23):61-64.

隗世波,刘青云,石雅娴.橙皮苷对脓毒症所致急性肾损伤大鼠的作用及其机制[J].中国新药与临床杂志,2020,39(08):494-498.

基金:湖北省卫生健康科研基金资助项目(WJ2019H216)