三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤的块根，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效[1]，广泛用于多种中成药。近年来，由于生长环境等因素造成的中药材中重金属、农药残留等不同程度超标，既影响用药安全，又限制中药材出口走向世界[2,3]。因此测定Pb、Cd、As、Hg、Cu5种有害元素及农药残留的含量对三叶青的质量控制及合理使用具有重要意义。本研究采用ICP-MS首次对不同产地三叶青中所含的5种重金属元素进行测定，且首次测定16种有机氯类农药残留，为全面精准评价三叶青质量奠定基础。

1、仪器与试药

Agilent7900型电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent科技有限公司）；mLli-QAdvan-tageA10超纯水系统（美国MERCKmLLIPORE公司）；CEMMARSXPERSS微波消解仪（美国CEM公司）；XS105型十万分之一电子天平（美国梅特勒-托利多公司）；Agilent6890N型气相色谱（美国Agilent科技有限公司）；8512型氮吹仪；AgilentDB-1701毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm）（美国）；Sigma1-14小型超高速离心机（德国）；DL-360D型智能超声波清洗器（上海精宏实验设备有限公司）。

Cu、As、Pb、Cd、Hg标准液（批号分别为16103、16052、12075、16074、16084；规格：1000μg/mL）购自中国计量科学研究院；Bi、Ge、In、Au单元素标准物质溶液（样品唯一性编号分别为GSB04-1719-2004、04-1728-2004、04-1731-2004、04-1715-2004；规格：1000μg/mL）购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；浓硝酸（优级纯，默克公司）；超纯水由二次去离子水经mLli-Q超纯水系统处理而得（电阻率≥18.2MΩ）。六六六（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、滴滴涕（p,p'-DDE、p,p'-DDD、o,p'-DDT、p,p'-DDT）、五氯硝基苯、六氯苯、七氯、环氧七氯、艾氏剂、顺式氯丹、反式氯丹标准液的批号分别为2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、1845、1846、2316、2317、2320、064、065，均购自农业部环境保护监测所；氧化氯丹标准液（批号20181205）购自北京北方伟业计量技术研究院。三叶青经浙江省丽水市中医院验收鉴定组副主任中药师蓝艳鉴定为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤的块根，具体见表1。

表1样品信息

2、方法与结果

2.1三叶青中重金属含量的测定[4,5,6,7,8]

2.1.1仪器参数

射频功率1500W；等离子体气体积流量15.00L/min；辅助气体积流量0.90L/min；载气体积流量1.09L/min；采样锥孔径1.0mm；截取锥孔径0.8mm；雾化温度室温；真空压力：1.21μPa；采样深度8mm；采样时间10s；分析模式为定量。

2.1.2标准溶液的制备

精密吸取Pb、As、Cd、Cu标准溶液适量，用2%硝酸稀释成含Pb、As、Cd、Cu质量浓度分别为1、1、0.5、10μg/mL的标准溶液。分别精密吸取上述配制的Pb、As、Cd、Cu标准溶液适量分别置于同一量瓶中，用2%硝酸稀释至刻度，制成含Pb、As质量浓度均为0、1、5、10、20μg/L，含Cd质量浓度为0、0.5、2.5、5.0、10.0μg/L，含Cu质量浓度为0、50、100、200、500μg/L的混合对照品溶液。精密吸取Hg标准溶液适量制成含Hg为0.1μg/mL的标准溶液，精密吸取上述标准溶液0、0.2、0.5、1、2、5mL分别置于100mL量瓶中，用2%硝酸制成系列Hg标准溶液。

2.1.3内标液的制备

精密吸取Ge、Bi、In标准溶液各0.1mL置同一100mL量瓶中，用2%硝酸稀释至刻度，摇匀，作为内标溶液。

2.1.4供试品溶液的制备

精密称取三叶青粉末0.2g，置聚四氟乙烯消解罐内，其中加硝酸8.0mL，混匀，浸泡过夜，置微波消解仪内进行消解，程序为由室温经5min升至120℃，保持3min；经5min升至150℃，保持10min；再经10min升至180℃，保持30min。消解完成后，消解液冷却至60℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入1µg/mL的Au单元素标准溶液200µL，用超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.5试样空白溶液的制备

精密吸取硝酸8.0mL置聚四氟乙烯消解罐内，除不加Au单元素标准溶液外，按“2.1.4”项下方法制备试样空白溶液。

2.1.6线性关系考察

取上述配制好的各浓度标准溶液，按照“2.1.1”项下条件进行测定。以标准溶液浓度为横坐标，测量值为纵坐标，绘制标准曲线，得到Pb、As、Cd、Cu、Hg各元素标准曲线方程分别为Y=0.0029X+0.0113,r=0.9996;Y=0.0059X+8.4428×10-5,r=1.0000;Y=0.0045X+4.2605×10-5,r=1.0000;Y=0.0800X+0.0076,r=1.0000;Y=0.0020X+7.0233×10-6,r=0.9991。

2.1.7精密度试验

取标准溶液及内标溶液，连续进样6次，Pb、As、Cd、Cu、Hg各元素的RSD值分别为1.7%、0.6%、0.7%、0.3%、1.8%。

2.1.8重复性试验

取同一批三叶青（广西河池），平行取样6份，按照“2.1.4”项下方法制备相应供试品溶液，按照“2.1.1”项下条件测定样品中Pb、As、Cd、Cu、Hg各元素的含量，测定值分别为0.823、0.262、0.102、3.270、0.015μg/g,RSD分别为1.7%、1.5%、1.0%、0.9%、1.9%。

2.1.9稳定性试验

取同一批三叶青（广西河池），按照“2.1.4”项下方法制备相应供试品溶液，分别于0、2、6、8、12、16、24h测定，Pb、As、Cd、Cu、Hg各元素的RSD分别为1.2%、1.4%、1.9%、1.1%、2.0%。

2.1.10加样回收率试验

取已测定的三叶青（广西河池）6份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按照“2.1.4”项下方法制备相应的供试品溶液，按照“2.1.1”项下条件测定各元素，计算得各元素的加样回收率为90.01%～99.20%,RSD均≤2.0%。

2.1.11样品测定

取各批次样品约0.2g，各2份，精密称定，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下条件测定，计算各元素质量分数，结果见表2。

2.2三叶青中农药残留的测定

2.2.1GC色谱条件

AgilentDB-1701毛细管柱（30m×0.32m×0.25μm),63Ni-ECD电子捕获检测器检，进样口温度230℃，检测器温度300℃，载气体积流量1.5mL/min，不分流进样，程序升温：初始温度60℃，保持0.3min，以60℃/min升至170℃/min，再以10℃/min升至220℃/min，保持10min，再以1℃/min升至240℃，15℃/min升至280℃/min，保持5min。进样量1μL。

2.2.2混合对照品溶液的制备

精密吸取BHC、DDT各异构体、五氯硝基苯、六氯苯、七氯、环氧七氯、艾氏剂、顺式氯丹、反式氯丹和氧化氯丹对照品适量，用正己烷稀释制成含农药5.0μg/mL的贮备液。精密量取上述各对照品贮备液1mL，置于50mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

2.2.3供试品溶液的制备

取供试品于60℃干燥4h，粉碎成中粉（过四号筛65目）。精密称取2g，置100mL具塞锥形瓶中，加水20mL浸泡过夜，精密加丙酮40mL，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定质量，用丙酮补足减失的质量，再加氯化钠约6g，精密加二氯甲烷30mL，称定质量，超声15min，再称定质量，用二氯甲烷补足减失的质量，静置使分层，将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置4h，精密量取35mL，于40℃水浴上氮吹至近干，加少量石油醚（60～90℃）如前反复操作至二氯甲烷和丙酮除净，用石油醚（60～90℃）溶解并转移至10mL具塞刻度离心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀释至5mL，小心加入硫酸1mL，振摇1min，离心（3000r/min)10min，精密量取上清液2mL，氮吹至适量，精密稀释至1mL，摇匀，即得。

表2三叶青样品中5种重金属元素测定结果(n=2)

2.2.4标准曲线的绘制

分别精密量取上述混合对照品贮备液1mL分别置100、50、20、10、5、2、1mL量瓶中，用正己烷制成分别含l、2、5、10、20、50、100ng/mL的溶液，即得。取混合标准溶液，进样量为1μL，按上述色谱条件进样，每个进样量进样3次，取3次峰面积的平均值。以峰面积和对照品的浓度绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表2。

2.2.5精密度试验

表3线性关系方程

取混合对照品溶液，连续进样6次，六氯苯、六六六、五氯硝基苯、γ-BHC、七氯、艾氏剂、β-BHC、δ-BHC、氧化氯丹、环氧七氯、反式氯丹、p,p'-DDE、o,p'-DDT、p,p'-DDD、p,p'-DDTRSD值分别为1.8%、1.2%、0.7%、0.8%、0.7%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.5%、0.5%、0.5%、0.8%、0.4%、0.5%。

2.2.6重复性试验

精密称取4号样品2g，平行取样6份，六氯苯和p,p'-DDD分别为2.3752、50.112ng/mL,RSD分别为1.7%、1.4%。

2.2.7稳定性试验

取4号样品溶液，分别于0、2、6、8、12、16、24h测定，结果表明农药残留在24h内稳定，六氯苯和p,p'-DDD的RSD为2.8%、3.2%。

2.2.8加样回收率试验

取已测定的4号样品6份，分别精密加入一定量的标准品溶液，按照样品测定项下方法制备，按照“2.2.1”项下条件测定，重复3次。结果六氯苯、五氯硝基苯、七氯、环氧七氯、γ-BHC和p,p'-DDD的回收率为89.10%～96.31%,RSD为1.9%～3.7%。

2.2.9样品测定

按“2.2.3”项下方法对不同产地三叶青样品进行处理，按照“2.2.1”项下色谱条件进行检测。结果，在所有样品中1、8、11、14、15、17、18、20号样品未检出有机氯农药残留（低于检出限）；2、9、16、21号检出环氧七氯，分别为0.0032、0.0028、0.0016、0.0105mg/kg;3、6号检出七氯，分别为0.0258、0.0079mg/kg;4、5、7、10、12、13、16号检出六氯苯，分别为0.0059、0.0022、0.0053、0.0021、0.0029、0.0022、0.0026mg/kg;7号检出γ-BHC，为0.0017mg/kg;12号检出五氯硝基苯，为0.0165mg/kg;4、5、6、13、19号样品检出p,p'-DDD，分别为0.1253、0.0025、0.0228、0.0037、0.0467mg/kg。但其残留量均低于《中国药典》2015年版第一增补本中参照人参项下规定，总BHC≤0.2mg/kg、总DDT≤0.2mg/kg、PCNB≤0.1mg/kg、六氯苯≤0.1mg/kg、七氯≤0.05mg/kg、艾氏剂≤0.05mg/kg和氯丹≤0.1mg/kg。色谱图见图1。

图1混合对照品(A)、样品(B)和阴性样品(C)的气相色谱图

1-六氯苯2-α-BHC3-五氯硝基苯4-γ-BHC5-七氯6-艾氏剂7-β-BHC8-δ-BHC9-氧化氯丹10-环氧七氯11-反式氯丹12-顺式氯丹13-p,p'-DDE14-o,p'-DDT15-p,p'-DDD16-p,p'-DDT

3、讨论

本实验采用气相色谱法对浙江、广西、云南、贵州、福建5个省份不同产地的21批三叶青进行了16种有机氯农药残留分析，采用ICP-MS法检测了上述三叶青药材中Pb、Cd、As、Hg、Cu5种重金属元素含量，方法具有简便、快速、灵敏度高的特点，能够满足样品分析。参照《中国药典》2015年版及2015年国际标准化组织颁布的《中医药-中药材重金属限量》国际标准[ISO18664:2015(E)][6]中对中药的重金属及有害元素限度：Pb≤5mg/kg,Cd≤0.3mg/kg,As≤2mg/kg,Hg≤0.2mg/kg,Cu≤20mg/kg，结果21批样品中Pb≤4.1677mg/kg,Cd≤0.1946mg/kg,As≤0.4550mg/kg,Hg≤0.0424mg/kg,Cu≤7.8925mg/kg，均在限度范围内。显示三叶青重金属含量较低，整体质量较好。在所有样品中，虽有部分检出有机氯残留，但其含量均远低于《中国药典》2015年版的限量要求，表明所测三叶青药材能够保证临床用药安全性。

中药材的重金属来源可能来自环境的污染、工业三废对其的直接或间接污染、药材运输加工过程中的污染等，重金属和农药残留是中药材的重要污染物。有机氯类农药脂溶性强，易在脂肪体中蓄积，可致神经、肝、肾损伤；重金属导致体内蛋白质变性，损害组织细胞的功能。本研究通过对不同地区三叶青样品中5种重金属元素含量和16种有机氯农药残留进行测定分析与比较研究，可为三叶青的重金属元素标准、农药残留标准制定提供依据，为其饮片生产和临床用药安全提供参考。

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基金:丽水市科技计划项目(2017ZDYF16).