肝纤维化是一种严重危害人类身体健康的疾病，若得不到及时、有效的治疗，最终会发展为不可逆转的肝硬化，甚至肝癌[1]。睡莲花是睡莲科睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲的干燥花蕾，主产于我国新疆的博湖、伊犁和阿勒泰地区[2]。睡莲花是维吾尔药抗肝炎复方制剂炎效迪娜尔糖浆的主要组成药材之一，《中华本草维吾尔药卷》中记载睡莲花具有清热补心、降热养肝、消炎止咳之功效，用于心虚、肝虚、热性感冒等疾病的治疗[3,4]。已有多篇文献报道，睡莲提取物具有较好的肝保护作用[5,6]。多酚和黄酮类化合物是睡莲花的特征性化学成分[7]。前期研究表明，富含黄酮的睡莲花总黄酮（NCTF）对四氯化碳（CCl4）致急性肝损伤有较好的防治作用[8]。NCTF的主要有效成分烟花苷和睡莲酚也对小鼠急性化学性和免疫性肝损伤均有较好的保护作用[9,10,11]。因此，基于前期研究结果，本研究通过CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，进一步探讨了NCTF的抗肝纤维化作用，以期为该有效部位及睡莲花的深入开发提供基础数据。

1、材料和方法

1.1动物

SPF级Wistar雄性大鼠68只，体质量180～220g，由新疆医科大学动物中心提供，动物质量合格证号No.65000700001098；许可证号SCXK（新）2018-0002。动物饲养环境为室温20～24℃，相对湿度50%～60%，每日光照12h，大鼠分笼饲养，自由摄食饮水，均用标准饲料，每周称定质量1次，大鼠适应性饲养1周后使用。

1.2药品与试剂

睡莲花药材于2018年9月购自新疆维吾尔药业有限公司，由新疆药物研究所何江副研究员鉴定为雪白睡莲的干燥花蕾。秋水仙碱（西双版纳药业有限公司，批号H53021369）；花生油（山东鲁花集团）；四氯化碳（CCl4，天津市致远化学试剂有限公司）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、IgG-HRP多聚体抗体（上海艾博抗贸易有限公司）；Ⅳ型胶原（CIV）、III型前胶原（PCIII）和层连蛋白（LN）检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；4%多聚甲醛、Masson三色染色液和羟脯氨酸（Hyp）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司)；总超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和一氧化氮（NO）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6(IL-6）酶联免疫分析试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3仪器

Caris200全自动化学发光免疫分析仪（厦门优迈科医学仪器）；VarioskanFlash酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；HZQ-C全湿恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；DK-8D电热恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；BS124S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KDC-2046低速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；MLS-3750高压灭菌器（日本三洋公司）；FM-40制冰机（北京长流科学仪器有限公司）。

2、方法

2.1NCTF的制备

将睡莲花药材粉碎后，用12倍量70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩至浸膏。浸膏以水混悬并通过大孔树脂吸附后，分别以水、30%乙醇和50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩得大孔树脂洗脱物。该洗脱物上聚酰胺树脂柱后，以水和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得NCTF。以烟花苷为对照品，NCTF经紫外分光光度计测定，总黄酮平均质量分数为61.11%。

2.2分组、造模及给药

大鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组、NCTF低、中、高剂量（50、100、200mg/kg）组和秋水仙碱（0.2mg/kg）组，对照组和模型组各10只，其余每组12只。自造模之日起，称取0.5、1.0、2.0gNCTF粉末，分别溶于100mL0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液中，用于NCTF低、中、高剂量组；称取2.0mg秋水仙碱溶于100mL0.5%CMC-Na溶液中，用于秋水仙碱（0.2mg/kg）组。除对照组大鼠sc花生油外，其余各组分别于大鼠背部sc50%CCl4花生油溶液（0.1mL/100g),2次/周，连续12周。各给药组在造模第2天按设定剂量（1.0mL/100g)ig药物，对照组和模型组ig等体积0.5%CMC-Na溶液，1次/d，连续12周。实验期间大鼠自由摄食饮水，每天观察各组大鼠活动情况。大鼠末次给药后，禁食不禁水24h，戊巴比妥钠麻醉大鼠，打开腹腔，腹主动脉穿刺取血，3000r/min离心15min，取上层血清于-80℃低温冰箱保存待检。采集血样后处死大鼠，完整取出肝脏和脾脏并用滤纸拭干，置于电子天平上测量肝质量和脾质量，计算肝（脾）脏指数。同时剪取肝组织进行常规病理学检查，剩余肝脏用液氮速冻，于-80℃保存待检。

2.3肝功能及肝纤维化指标检测

采用全自动生化仪检测血清中ALT、AST、ALB、ALP和TP水平；通过放射免疫分析法检测血清HA水平，ELISA法检测血清LN、PCIII、CIV、TNF-α、IL-1β和IL-6水平。酶标仪测定大鼠血清中MDA、SOD、GSH和NO水平。

2.4肝组织Hyp的测定

取1.0g大鼠肝脏组织，低温条件下剪碎，于匀浆器中研磨成浆，加9倍冰生理盐水制成10%肝匀浆液，离心取上清液，按试剂盒说明测定大鼠肝匀浆中Hyp水平。

2.5病理组织学检查

剪取肝组织左叶，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚5μm，分别进行HE染色和胶原特异性纤维Masson染色，于光学显微镜下观察肝组织病理变化。对Masson染色结果进行半定量分析，肝纤维化程度分级标准[12]为：0级，无纤维化；1级，轻度纤维化，纤维化沉积仅位于小叶中央，无纤维间隔形成；2级，中度纤维化，纤维沉积扩散至小叶中央之外，汇管区纤维间隔形成，但未至小叶边缘；3级，重度纤维化，纤维沉积扩散至小叶边缘，广泛的汇管区纤维间隔形成；4级，肝硬化。

2.6免疫组化法检测肝组织中α-SMA表达

肝组织切片脱蜡后，以3%H2O2去除内源性过氧化物酶，用0.01mol/L枸橼酸抗原修复液对组织抗原进行微波修复，冷却到室温后，加一抗α-SMA封闭过夜后，滴加二抗（IgG-HRP多聚体抗体），室温孵育1～2h。PBS液冲洗后，DAB显色，中性树胶封片，于光镜下观察。

2.7统计学分析

应用SPSS25.0软件进行统计分析，各组数据结果以表示，计量资料采用方差分析，等级资料采用Ridit分析。

3、结果

3.1NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠体质量和脏器指数的影响

对照组大鼠毛色光滑，精神状态较好，体质量在实验期间不断增长。与对照组相比，模型组大鼠体毛明显变黄，精神萎靡不振，食欲下降，体质量明显减轻，实验过程中有2只大鼠死亡。NCTF低、中剂量组和秋水仙碱组各有1只大鼠死亡，其余给药组大鼠毛色、精神状态和摄食等明显优于模型组。

如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠体质量减轻、肝脏指数和脾脏指数增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，NCTF高剂量组能显著降低大鼠肝脏指数（P<0.01);NCTF低、中、高剂量组和秋水仙碱组均能显著降低肝纤维化大鼠的脾脏指数（P<0.05、0.01），并能显著增加大鼠体质量（P<0.05、0.01）。结果表明NCTF能够显著改善CCl4导致的肝脾充血、肿大。

3.2NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠血清生化指标的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST、ALP水平显著增加（P<0.01),TP和ALB水平明显下降（P<0.01），说明CCl4成功诱导大鼠肝损伤。与模型组相比，NCTF低、中、高剂量组和秋水仙碱组均能明显降低大鼠血清中ALT、AST、ALP水平（P<0.05、0.01），并能明显提高血清TP和ALB水平（P<0.01），且具有剂量相关性。结果表明NCTF具有较好的保护肝细胞、改善肝功能作用。

3.3NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CIV水平的影响

由表3可得，与对照组相比，模型组大鼠血清中HA、LN、PCIII、CIV水平显著增加，差异具有统计学意义（P<0.01），说明CCl4成功诱导大鼠肝纤维化。与模型组相比，NCTF低、中、高剂量组和秋水仙碱组均能明显降低大鼠血清中的HA、LN、PCIII、CIV水平（P<0.05、0.01）。结果提示NCTF具有明显的抗肝纤维化作用。

表1NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝脾指数的影响

与对照组比较：#P<0.05##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01，下表同

表2NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、ALP、TP和ALB水平的影响

表3NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CIV水平的影响

3.4NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织Hyp水平的影响

由表4可见，与对照组相比较，模型组大鼠肝组织Hyp水平明显增加（P<0.01),CCl4导致大鼠肝纤维化的产生。与模型组相比，NCTF高剂量组和秋水仙碱组可显著降低大鼠肝组织Hyp水平（P<0.05）。结果说明NCTF具有降低纤维化大鼠肝组织中的胶原纤维表达的功能。

3.5NCTF对肝纤维化大鼠血清SOD、MDA、GSH和NO水平的影响

如表5所示，与对照组相比较，模型组大鼠血清MDA、NO水平显著增加（P<0.05、0.01),SOD和GSH水平明显减少（P<0.01）。与模型组相比，NCTF中、高剂量组和秋水仙碱组均能明显降低MDA、NO水平（P<0.05、0.01），并显著提高大鼠血清SOD和GSH水平（P<0.05、0.01）。结果说明NCTF可通过抗氧化活性发挥保护肝的作用。

3.6NCTF对肝纤维化大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影响

如表6所示，与对照组相比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著提高（P<0.01）。与模型组相比较，NCTF低、中、高剂量组均能显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平（P<0.01）。结果说明NCTF可通过调节免疫，抑制促炎细胞因子的表达而发挥抗肝纤维化的作用。

表4NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织中Hyp水平的影响

表5NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠血清SOD、MDA、GSH、NO水平的影响

表6NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平的影响

3.7NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响

HE染色法是判断炎症细胞浸润、细胞脂肪变性、坏死等肝损伤状态的常用病理检测手段。如图1所示，对照组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐无胶原纤维增生。模型组大鼠肝细胞排列紊乱，纤维结缔组织增生，汇管区炎性细胞及坏死细胞增多，增多的胶原纤维形成条状纤维间隔，肝脏门束区出现增厚的纤维隔板，可见假小叶形成。NCTF低、中、高剂量组和秋水仙碱组对纤维化程度均有不同程度的改善，仅纤维隔内可见炎细胞浸润。

Masson染色法常用于鉴别胶原纤维和肌纤维的，可准确判断肝组织纤维化的程度。如图2和表7所示，对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，仅于汇管区血管周围有少许胶原纤维染色，无明显胶原增生。模型组大鼠肝脏组织中纤维明显增多，胶原纤维沿汇管区或炎症坏死区向外延伸，形成薄厚不一的纤维间隔，多位于汇管区和血管周围，分割包围肝小叶，有明显的结节样假小叶形成。NCTF低、中、高剂量组能不同程度地减少胶原纤维组织增生及纤维化程度，其中尤以高剂量组作用显著，效果接近秋水仙碱组。

图1NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响(HE,×100)

图2NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响(Masson,×100)

表7NCTF对CCl4致大鼠肝纤维化分级变化程度的影响

3.8NCTF对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA表达的影响

由图3和表8可知，对照组大鼠肝组织中少见α-SMA棕色阳性表达。模型组大鼠α-SMA阳性表达主要位于间质细胞和胞浆中，呈现明显的棕色；与对照组相比，其表达量明显上升（P<0.01），肝组织纤维化程度明显。与模型组相比，NCTF低、中、高剂量组和秋水仙碱组大鼠肝组织细胞间质中α-SMA的表达量显著减少（P<0.01）。

图3NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织α-SMA蛋白表达的影响(免疫组化,×200)

表8NCTF对CCl4致肝纤维化大鼠肝组织α-SMA蛋白表达的影响

4、讨论

CCl4是一种典型的肝毒性药物，单剂量给予CCl4可导致脂肪变性、坏死的肝细胞损伤，长期给药可导致肝纤维化、肝硬化和肝癌[13]。CCl4诱导的肝纤维化动物模型具有耗时短、成模率高及其病理组织学变化与人类肝纤维化相似的特点，现已被广泛应用于抗肝纤维化天然药物的研究之中。scCCl4诱导的大鼠肝纤维化简单易行，但存在死亡率高的缺点[14]。本实验模型组大鼠在造模第11、12周，分别死亡1只；NCTF低、中剂量组和秋水仙碱组大鼠在实验第3、7、9周各死亡1只。造模12周后，病理组织学观察显示剩余模型组大鼠肝脏均出现了损伤和纤维化，血清ALT、AST、ALP水平显著升高，ALB、TP水平明显下降，肝细胞受损严重。经不同剂量的NCTF和秋水仙碱治疗后，以上血清生化指标及肝组织病理损伤纤维化状况均得到不同程度的改善。同时，NCTF可逆转CCl4导致的大鼠血清NO、脂质过氧化产物MDA水平增加和GSH、SOD水平降低，说明抗氧化是NCTF保肝作用的机制之一。

肝纤维化的本质是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复反应时，以胶原蛋白为主要组分的细胞外基质（ECM）在肝内大量沉积的病理过程[15]。肝星状细胞（HSC）是肝脏ECM的主要来源，HSC的表型激活和过度增殖是肝纤维化形成过程的关键所在。因此，抑制HSC的活化及增殖、诱导HSC凋亡、抑制ECM过度沉积可逆转肝纤维化的发展。α-SMA是HSC激活的标志物，与HSC增殖及肝纤维化程度呈正相关[16]。NCTF干预后，α-SMA的阳性表达较模型组明显降低，说明HSC的激活可被NCTF抑制，肝纤维化得到改善。

胶原所特有的氨基酸成分Hyp是其降解产物，它的含量可反映胶原代谢的变化情况，且与肝纤维化程度相平行[17]。NCTF降低了CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型肝组织中Hyp水平，高剂量组（200mg/kg）作用尤为显著。血清PCIII是III型前胶原在细胞外形成原胶原前，被相关酶切下后进入血液循环的氨基端尾肽，故被视为纤维化形成的血清学指标。CIV胶原是反映基底膜变化的可靠指标，随慢性肝炎的阶段性病变，CIV含量逐步升高[18]。HA水平可反映肝纤维化的程度，肝脏内皮细胞是清除血液中HA的主要场所。LN在纤维化中的作用主要是连接基质中的大分子成分，共同参与基膜的形成及肝血窦的毛细血管化。肝纤维化时LN的浓度明显升高[19]。临床实践表明，PCIII、CIV、HA和LN水平与肝组织炎症活动及纤维化均呈正相关[20,21]。本研究发现模型组大鼠血清PCIII、CIV、HA和LN水平明显升高，说明CCl4引起了大鼠肝组织的损伤及纤维化。给予NCTF干预后，大鼠血清PCIII、CIV、HA和LN水平均有显著下降，说明NCTF具有阻抑纤维化的作用。CCl4诱导的肝损伤可造成促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的增加，这些细胞因子的不断刺激又可进一步加重肝损伤，形成恶性循环，导致肝纤维化发生发展。与模型组相比较，不同剂量的NCTF均可显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平。结果说明NCTF可通过减少促炎细胞因子的表达而发挥抗肝纤维化的作用。

综上所述，NCTF具有较好的抗肝纤维化作用，其作用机制与抗氧化、抑制脂质过氧化、调节胶原合成、减少促炎因子表达相关。本研究为睡莲花药效物质基础的揭示及其富含黄酮有效部位的开发利用提供了科学参考。

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基金:国家自然科学基金资助项目(81760631);新疆维吾尔自治区公益性科研院所科研基本业务费资助项目(ky2019104).