蛤蚧为爬行纲(Reptilia)壁虎科(Gekkonidae)壁虎属(Gekko)大壁虎(Gekkogecko)除去内脏的干燥体，是我国传统名贵中药材，《本草纲目》、《开宝本草》、《海药本草》等都记载有蛤蚧的药用价值，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效，用于治疗肺肾不足、虚喘气促、劳嗽咳血、阳痿、遗精等病症[1,2]。以“蛤蚧”为君药的蛤蚧定喘丸、蛤蚧定喘胶囊、蛤蚧补肾胶囊等中成药及相关产品应用广泛。蛤蚧生活在热带和亚热带地区，主要分布于我国广东、广西、香港、福建及云南等地，尤以广西为多，其体型较细，体色较深，色斑较杂，又称为黑斑蛤蚧或灰斑蛤蚧。因人们大肆捕杀及对其栖息地严重破坏，国内的野生蛤蚧资源越来越少，现列为我国Ⅱ级重点保护动物[3]。

由于药源的匮乏及需求的膨胀，据市场调查蛤蚧的伪品达17种[4]:红斑蛤蚧，中国壁虎(Gekkochinensis)、无蹼壁虎(G.swinhonis)、多疣壁虎(G.japonicus)、荔波壁虎(G.liboensis)、睑虎(Goniurosauruslichtenfelderi)、喜山鬣蜥(Laudakiahimalayana)、变色树蜥(Calotesversicolor)、蜡皮蜥(Leiolepisreevesii)、西藏沙蜥(Phrynocephalustheobaldi)、青海沙蜥(P.vlangalii)、中国石龙子(Eumeceschinensis)、中国瘰螈(Paramesotritonchinensis)、红瘰疣螈(Tylototritonverrucosus)、贵州疣螈(T.kweichowensis)、山溪鲵(Batrachuperuspinchonii)、东方蝾螈(Cynopsorientalis),这可能会扰乱市场，对临床用药产生了巨大的安全隐患。蛤蚧药材的鉴别，过去主要是经验性的性状鉴定[4],随着现代科学技术的发展，显微鉴定[5]、紫外吸收光谱和高效液相色谱[4]、薄层色谱[6]、特征谱带[7]、X衍射Fourier谱分析[8]、蛋白质理化性质[9,10]、蛋白质电泳[11,12,13]等方法在蛤蚧材的鉴定中起到了重要作用。这些方法虽然简便、快速，但对破碎药材、粉末药材、饮片以及中成药等，这些鉴定方法存在一定的局限性。随着分子生物学技术的发展和不断完善，其理论和技术不断渗透到中药鉴定领域，涌现了一批中药材分子鉴定技术，特别是DNA条形码技术的提出，是近年来中药材鉴定的热门研究方向。目前利用分子鉴定技术对蛤蚧药材已有一定的研究，根据分子鉴定所需的分子标记技术的分类[14],本文分别以PCR、重复序列为基础的分子标记技术以及DNA序列分析对蛤蚧的分子鉴定方法、内容和结果等方面进行了整理和总结，以期为含蛤蚧的药材、饮片、中成药等安全性和有效性质量评价以及市场监管提供一定参考。

1、以PCR为基础的分子标记技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)方法能使在体外从微量(理论上为一个分子)DNA模板可以合成大量特异DNA成为现实，是分子生物学领域最常用的方法之一[15,16,17,18]。该技术发展到现在，主要包括随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNAs,RAPD)、标记位点测序(sequnce-taggedsite,STS)、特征扩增区段测序(sequence-characterizedamplifiedregions,SCAR)、寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)、单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCR-PCR)、小寡核苷酸DNA分析(smalloligoDNAanalysis,SODA)、DNA扩增产物指纹分析(DNAamplificationfingerprinting,DAF)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)等，其中RAPD和AFLP的应用比较广泛。

RAPD技术是由美国科学家Williams与Welsh于1990年同时提出的一种DNA分子标记技术，此技术利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。在基于PCR为基础对蛤蚧进行分子鉴定中，QING等[19]应用RAPD技术，使用21个重复性好、扩增产物清晰的引物(10bp),分析6个不同地区(河池、南宁、桂林、百色、越南、泰国)蛤蚧的遗传多样性和系统关系，结果共检测到218条扩增片段，其中有184条是多态片段，地区间的遗传距离指数在0.0112～0.9631,遗传相似性系数在0.3817～0.9888,相似性较低，亲缘关系较远。这表明蛤蚧的系统关系与形态地理分布特征相一致，南宁地区、桂林地区、百色地区和河池地区先聚在一起，再和越南聚在一起，最后和泰国的种群聚类，意味着RAPD技术可以对黑斑蛤蚧(正品)和红斑蛤蚧(伪品)种群进行有效鉴别。

特异性PCR技术是根据各物种之间基因序列存在差异，某一段序列只存在于某种动物的基因片段中，由此设计出的特异性引物只能扩增该段序列的一种方法。LIU等[20]根据蝾螈科(Salamandridae)、壁虎科(Gekkonidae)、鬣蜥科(Agamidae)共13种线粒体12SrRNA基因片段序列，设计了一对鉴别蛤蚧的位点特异性引物，用该引物扩增蛤蚧和其伪品原动物的DNA模板，只有蛤蚧有明显的扩增带，而其他物种没有。同时，用此法对不同来源的9个蛤蚧药材样品进行了鉴定，其中只有3个样品为正品蛤蚧，结果与形态鉴定一致。顾海丰等[21]以线粒体的部分基因包括细胞色素b(cytochromeb,Cytb)、细胞色素C氧化酶I亚基基因(cytochromecoxidasesubunitI,COI)、12SrRNA和16SrRNA为基础，同时从GenBank上下载30条序列，设计了4对位点特异性引物：COISF(5′-TAATCTAGCACATGCAGGCGCATCT-3′)和COISR(5′-ACGATCGGTCAGCAATATAGTGATG-3′)、CytbSF(5′-TACTGCAAACACATCCCTCGCATTTCA-3′)和CytbSR(5′-TACTGCAAACACATCCCTCGCATTTCA-3′)、16SrRNASF(5′-CCTTAAATAGGGGCTGGTATGAACGGCTG-3′)和16SrRNASR(5′-CCTTGGCGATATGGGCTCTTGAAGG-3′)、12SrRNASF(5′-GCACGTCAGGTCGAGGTGTAGCTAAC-3′)和12SrRNASR(5′-TCAGGCATGACTTGCCTTGGTTTACTA-3′)。结果表明在复性温度为65℃时，这4对引物都出现了理想的结果，即蛤蚧正品出现了扩增条带，而伪品没有扩增条带。可见，这些研究均表明特异性PCR技术可快捷、准确的鉴定蛤蚧及其伪品。

快速PCR技术是在特异性PCR技术基础上的进一步发展，通过结合DNA快速提取[22],在确保PCR反应灵敏度和特异性的前提下，快速PCR扩增和提高检测效率[23],能在30～40min内实现真伪鉴别。JIANG等[24]通过对比蛤蚧及其伪品的COI序列，设计了蛤蚧特异性PCR鉴别引物(GejieF:5′-CACTCCTTGGACACGACCAACT-3′,GejieR:5′-AGGGGTGTCGTGTATTGGGTC-3′),优化特异性PCR条件，对蛤蚧及其7种常见混淆品进行扩增及荧光检测，结果表明所有蛤蚧药材均能扩增出约400bp的特异性条带，然后加入SYBRGreenI染料后，在365nm下出现强烈绿色荧光，然而混伪品不具特异条带和绿色荧光，鉴别操作可在30min内完成。可见，快速PCR技术结合荧光染料检测为蛤蚧及其伪品的快速鉴定提供了新的方法。

环介导等温环化扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术是指利用特异设计的2对普通引物和一对或一条环引物，在等温条件下，对目标片段进行快速特异扩增的方法，具有特异性强、灵敏度高、扩增速度快等优点[25]。SU等[26]基于12SrRNA序列设计了蛤蚧及其伪品的LAMP引物，并优化扩增条件，结果表明该方法特异性强、灵敏度高、检测方便、反应时间短，且闭管操作，避免了污染，可实现蛤蚧与混伪品的快速可视化鉴别。与特异性PCR技术等方法相比，环介导等温扩增技术扩增量大，不仅检测时间短，而且仪器要求和操作均简单，整个检测过程不需要PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统，只需要水浴锅就能完成，并可用肉眼观察颜色即可判断结果，更适用于现场检测[27]。

从上述研究可以看出基于PCR为基础的分子鉴定方法对于引物设计尤为重要。引物设计首先确认研究对象的目的基因片段较为保守，这可从已发表的文献查找或者从GenBank等数据库上下载目的序列进行比对分析，然后从比对结果中找到核心保守序列作为引物设计位点，接着利用Primer5.0程序[28]设计特异性引物。此外，也可以在PremierPrimer5.0(http://www.Premierbiosoft.com/primerdesign/)在线设计引物，操作方便。引物设计可参考PCR引物设计的一般原则[29],主要包括(1)引物长度为18到24个碱基，退火温度尽可能一致；(2)引物序列的GC含量一般为40～60%;(3)减少引物多义性，应尽量避免3′末端的多义性；(4)引物3′端的碱基，特别是最末碱基，应严格要求配对；(5)选用3′端ΔG值(DNA双链形成所需的自由能)较低，而5′端和中间ΔG值相对较高的引物；(6)避免引物内部出现二级结构、发卡结构、二聚体、错配现象。经比较这四种以PCR为基础的分子鉴定方法(RAPD技术、特异性PCR技术、快速PCR技术和环介导等温环化扩增)的仪器需求(表1),可见，环介导等温环化扩增技术对仪器需求最简单，其次是快速PCR,适合于现场检测和非专业技术人员的操作。

表1基于PCR为基础的四种分子鉴定方法对仪器设备需求比较

2、以重复序列的分子标记技术

重复序列是指基因序列的多拷贝，在基因组中广泛存在，主要包括有卫星DNA(重复单位为几百至几千碱基对)、小卫星DNA(重复单位为大于5bp)、微卫星DNA(重复单位为2～5bp)以及串珠式重复序列。在蛤蚧的分子鉴定研究中，目前WANG等[30]和PENG等[31]是通过使用微卫星标记技术(9个位点，208个不同等位基因)对黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧进行了鉴定，结果发现红斑蛤蚧的遗传变异显著高于黑斑蛤蚧，它们之间存在显著的遗传变异，这表明微卫星标记技术也可用于它们之间的鉴定。然而，目前基于重复序列在蛤蚧鉴定中的研究比较少。

3、DNA序列分析

在基因序列分析技术中，主要包括线粒体DNA、叶绿体DNA、核基因序列分析。近年兴起的DNA条形码(DNAbarcoding)技术处于物种鉴定的前沿，主要利用标准的一段或几段短的基因组DNA片段对生物物种进行快速和准确鉴定的技术，因其易于操作、准确、可标准化等特点备受关注[32,33]。DNA条形码技术已被证明可高效的鉴定物种，特别是以线粒体COI(648bp)作为条形码序列可以解决了95%的物种水平的鉴定[32]。GU等[34]通过采用通用引物(LCO1490:5′-TCCACTAATCACAARGATATTGGTAC-3′,HCO2198:5′-GAAAATCATAATGAAGGCATGAGC-3′)[35]对55个蛤蚧及伪品样本(无蹼壁虎、多疣壁虎、睑虎、中国瘰螈、红瘰疣螈、山溪鲵、东方蝾螈)的DNA条形码进行扩增，所获得的序列经ClustalX[36]比对及人工校正以及用PAUP*4beta10软件[37]对它们两两序列之间的多态性进行分析，结果表明蛤蚧同伪品间的差异达到35%,种间的差异明显高于种内，表明DNA条形码可有效的鉴定蛤蚧及其伪品。ZHANG等[38]对蛤蚧及混伪品的11个物种(中国壁虎、无蹼壁虎、多疣壁虎、睑虎、变色树蜥、喜山岩蜥、青海沙蜥、红瘰疣螈、山溪鲵、东方蝾螈)共103份样品的DNA条形码进行序列扩增，利用CodonCodeAligner(http://www.codoncode.com/aligner)对测序序列拼接并校正，最后用软件MEGA6.0(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)[39]对校正后的序列比对，然后进行遗传距离分析和邻接(neighborjoining,NJ)树构建，结果表明蛤蚧COI序列(658bp)种内平均K2P(Kimuratwo-parametermodel)距离为0.005,种内最大K2P距离为0.013,基于COI序列构建的NJ树中蛤蚧单独聚在一支，与其混伪品可以相互区分。可见该研究基于COI的DNA条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品，但是构建的NJ树没有明确的外群，并且蛤蚧和部分伪品(中国壁虎、无蹼壁虎、睑虎、多疣壁虎、山溪鲵、东方蝾螈、红瘰疣螈)构成并系。

虽然DNA条形码最常用的是COI基因，然而，线粒体编码核糖体基因如12SrRNA、Cytb等，也常用作DNA条形码进行研究。LIU等[40]使用引物(L1091:5′-AAAAAGCTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3′,H1478:5′-TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3′)测定5个蛤蚧样品(3个新鲜样品和2个药材样品)的线粒体12SrRNA共400bp的片段序列，结果表明5个样品明显地可以分为两种单倍型，然而蛤蚧种内的差异比它与壁虎科其它物种间的差异小，且形态学、染色体组型上无明显异，认为该基因片段无法区分蛤蚧种内的差异。然而由于样品数量太少，该结果需更多研究的验证。HAN等[41]使用引物L1091/H1478引物对我国壁虎科10种壁虎动物(蛤蚧、多疣壁虎、无蹼壁虎、铅山壁虎、长弯脚虎、灰弯脚虎、吐鲁番沙虎、原尾蜥虎、疣尾蜥虎、截趾虎)12SrRNA的基因片段进行了测序，采用ClustalX[36]对获得序列拼接并校正，使用MEGA进行序列差异分析，并用邻接法、非加权组平均(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans,UPGMA)法和最大简约(maximumparsimony,MP)法重建系统树，结果显示序列经比对校正后共有421bp,属间核苷酸变异范围为0.228～0.282,属内为0.005～0.263,系统树上蛤蚧和截趾虎聚成一支，并与其它物种区分，这表明采用12SrRNA是可以把蛤蚧和壁虎科其他种区分。ZHANG等[42]使用引物L1091/H1478测序了黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧共6个样品的12SrRNA基因片段，分析了黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧间的遗传变异和使用NJ和MP法分别构建了它们之间的系统进化关系。结果显示序列经比对校正后共有389bp,红斑蛤蚧间变异范围为1.18%～1.91%,黑斑蛤蚧间为2.36%～3.64%,红斑蛤蚧与黑斑蛤蚧之间为4.81%～6.73%,外群壁虎与蛤蚧内群间变异为30.44%～35.69%,系统发育树结果表明黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧分别自构成单系，可见使用12SrRNA是可以对黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧进行鉴别。QIN等[43]以Cytb作为分子标记，对广西12个地区(平果、都安、平乐、昭平、扶绥、桂平、德保、忻城、合山、覃塘、上思、宁明),以及越南凉山和老挝孟威的蛤蚧进行研究，序列经比对和校正后为424bp,定义了7个单倍型，分别采用NJ和MP法构建了蛤蚧不同地理种群的系统发育关系，结果显示广西黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧种群之间的平均遗传距离为8.60%～9.50%,达到了亚种或种分化的差异。而QIN等[44]继续采用Cytb分析广西百色的黑斑蛤蚧和老挝红斑蛤蚧的关系，获得Cytb基因全序列1147bp,分别采用NJ和MP法构建了2种蛤蚧的系统发育关系，黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧的Cytb基因的差异程度达到9.18%,NJ和MP树均显示黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧明显分为二支，这些结果可见使用该Cytb基因片段能对黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧进行鉴别。

在药材使用上，蛤蚧通常是干燥保存，这样的保存方法使得DNA的提取十分困难，导致标准DNA条形码长度(648bp)较难获得，从而使得DNA条形码技术难以实施。鉴于蛤蚧样品的特点，运用微型DNA条形码(mini-barcode)技术有助于解决了蛤蚧干燥体提取DNA困难的问题。微型DNA条形码，即基于标准条形码5'的序列，长约150bp,这样的短片段一般不受样品长期保存的限制，较容易获得。李力等[45]使用微型DNA条形码对蛤蚧药材及伪品共61个样本进行了鉴定，分别设计了mini-arcodeF2(5′-TCRACCAATCAYAAAGATATYGGCAC-3′)和操作mini-barcodeR2(5′-GAARATYATTACMARTGCATGAGC-3′);mini-barcodeF3(5′-TCCACCAATCAYAAAGATATTGGCAC-3′)和mini-barcodeR3(5′-GAAAATYATTACMAATGCATGAGC-3′)两对微型条形码的引物，结果表明微型条形码的扩增效率达到90%以上，能成功对蛤蚧药材及其伪品进行鉴定。

从上述研究可以看出基于基因序列的分子鉴定方法首先确定正品和其混伪品间的基因片段，然后设计它们的特异性引物，然后通过PCR扩增和测序获取目的基因片段的序列，最后通过BLAST法(BLAST-BasedMethod),或距离法(distance),或建树法(tree-building),或它们之间共同对序列进行分析，以确定鉴定结果。BLAST法得到的物种鉴定率最高，而距离法和建树法得到的物种鉴别率相差不大[14](图1)。BLAST法是一种基于BLAST搜索算法，需要建立或者在如GenBank数据库上下载物种鉴定的参考序列构成数据库，以便开展后续的基因片段的分析和物种鉴定工作。距离法主要通过MEGA或PAUP等软件，计算种内和种间的遗传距离，当种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离表明物种间可鉴定；建树法则通过进化模型构建NJ或MP树等，如果某一物种所有个体聚为一个单系分支，则物种间可鉴定[14]。总之，PCR扩增成功与否是获得基因序列的关键步骤，是基于基因序列的分子鉴定方法的关键步骤。此外，样品的数量和基因片段的长短也会影响到鉴定结果。

图1基于基因序列的分子鉴定方法的一般操作流程

4、展望

蛤蚧作为我国的名贵中药材，野生资源越来越少，虽人工养殖技术已没有问题[46],但是人工养殖规模仍没有得到有效扩大，目前仍是较为紧缺的贵重中药材，市场需求量巨大，出现的伪品越来越多，依靠现在的性状、显微和理化鉴别，难以准确的对包含蛤蚧的药材、饮片及中成药进行真伪鉴别。上述的研究均表明分子鉴定技术在蛤蚧真伪品鉴定中具有重要的应用价值，并已经取得了重要的进展，有广阔的应用前景。对于将来蛤蚧的分子鉴定技术研究，可以从以下几个方面进行探讨：

a.在上述研究中，所采用的蛤蚧伪品不齐全，最多仅为10种[43],还有部分伪品因各种原因而无法一起研究，这很容易让不法分子钻空子，对于市场监管来说也是严峻的挑战。因此，将来研究可全面收集蛤蚧及其伪品进行分子鉴定，有助于全面地厘清它们之间的关系，为药材的安全使用提供理论依据。

b.上述分子鉴定研究主要以蛤蚧新鲜样品或干药材而进行，而对蛤蚧饮片、含蛤蚧的中成药如蛤蚧定喘丸、蛤蚧补肾胶囊、蛤蚧定喘胶囊等的分子鉴定报道较少。此外，从上述研究中可以发现，主要以线粒体基因(COI、12SrRNA、Cytb)为分子标记。近年来，高通量测序技术的快速发展以及测序成本的持续下降，将高通量测序技术与DNA条形码鉴定技术相结合，便发展出可同时检测到混合样本中多个物种条形码序列的新技术—DNA宏条形码(DNAmetabarcoding)[47,48],已成功应用于六味地黄丸[49]、如意金黄散[50]、九味羌活丸[51]等中成药的药材成分的鉴定。可见，运用DNA宏条形码技术可最大程度地实现含蛤蚧的中成药鉴定，可高覆盖度地测得其组分。这比一般仅适用于对中成药中的几味药材的鉴定和适用范围有限的传统鉴定方法有很大优势[52]。因此，为确保药材市场中蛤蚧的质量及其临床疗效，将来研究中需全面地对蛤蚧及其所有伪品、饮片和中成药进行成分鉴定，为蛤蚧安全性和有效性质量评价以及市场监管提供一定参考。

陈广玉,田慧,赵成坚,李炎连,邓麒容,黄勇.蛤蚧分子鉴定技术研究进展[J].沈阳药科大学学报,2021,38(03):328-334.