中药注射剂已有60多年的发展和临床应用历史，是我国临床的独特治疗手段，是中医药文化的组成部分，发挥着不可替代的作用[1,2,3]。由于对其基础研究比较薄弱，近年来鱼腥草注射剂的不良反应日益凸显，临床安全事件时有发生。鱼腥草注射剂所致的不良反应可累及机体多个器官系统，临床表现复杂多样，严重不良反应常见有呼吸困难、急性肺水肿、喉头水肿、心跳呼吸骤停甚至造成死亡。鱼腥草注射剂过敏反应是其主要的不良反应类型，也是致死亡的主要原因[4,5,6]。

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜HouuuyniacordateThunb.的新鲜全草或干燥地上部分，其性味辛、寒，《中国药典》2020年版载其具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，常用于肿痈吐脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒的治疗[7,8,9]。鱼腥草的化学成分中含挥发油0.049%，挥发油的主要成分为鱼腥草素，即癸酰乙醛、癸醛、月桂醛、甲壬酮等61种成分[10,11,12,13,14,15]。鱼腥草注射剂的（类）致敏性，既与单成分的（类）致敏性相关，更与其形成的超分子结构特征相关，其强度决定于超分子结构特征，包括大小、表面积及鱼腥草挥发油成分基团在表面分布情况等。这一现象可用超分子化学的“印迹模板”自主作用机制进行解释[16]。

超分子化学根源于配位化学，亦被称为广义配位化学，是近30年来迅速发展起来的一门交叉学科，与材料科学、信息科学、生命科学等学科紧密相关，是当代最前沿的化学研究领域之一[17,18,19,20]。基于超分子化学，人体与中药可以看成是1个由单分子、超分子、聚合超分子及巨复超分子构成的复杂体系[21]。其中免疫应答是人体重要的超分子“印迹模板”识别、拷贝、贮存与复制的过程，当中药注射剂进入人体后，具有“印迹模板”特征的致敏原经过免疫识别，拷贝产生具有相同“印迹模板”特征的抗体并储存起来。当具有相似或者相同“印迹模板”特征的致敏原再次进入人体之后，被储存的抗体识别，从而产生免疫应答反应，亦为致敏反应。

在超分子化学理论的指导下，通过对鱼腥草注射剂的结构及其致敏性进行研究，有可能为解决这一问题提供新的研究思路。多成分的中药注射剂可能通过非固有的分子间化学键自主结合形成超分子结构，在“口服”给药时，这种形式被肠胃道消化吸收的屏障所拆散与破坏，只能拆散吸收进入血液而难生成超分子结构，其表观分子量小，决定簇少，致敏反应小，不易引起致敏反应，对机体安全；如果以注射给药途径给药，这种超分子结构得以保留，可直接进入血液，表观分子量大，决定簇多，表观致敏反应强，易引起致敏反应，对机体表现出较强的免疫毒性[22,23,24,25]。

在此之前，本课题组已经获得了鱼腥草挥发油体外成分的“印迹模板”，即通过对色谱峰进行划分归属，最终确定发挥作用的关键成分群（印迹模板）[26]。由此，本研究尝试将该法进一步推广至体内成分的研究，通过对不同时间点体内成分进行气质联用（GC-MS）检测，划分成若干个成分群（印迹模板），再与免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE,IgE）含量进行非线性回归，最终得到各个成分群的贡献排序，即过敏原的排序。

1、材料

1.1 药品与试剂

鱼腥草注射剂（批号0806413）购自湖南正清集团公司；小鼠血清IgEELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 动物

SPF级昆明种小鼠84只，雌雄各半，5～6周龄，体质量18～22g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，室内温度20℃，相对湿度55%。动物实验经湖南中医药大学伦理委员会批准（批准号LLBH-201607230003）。

1.3 仪器

ELEX-800型酶标仪（美国BioTek公司）；QP2010型气质联用仪（GC-MS，日本岛津公司）；CP-114型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；TGL20型低温离心机（长沙英泰仪器有限公司）。

2、方法

2.1 总量统计矩法和信息熵的基本理论

总量统计矩法是将统计矩原理应用于表征指纹图谱特征，一张完整的指纹图谱可看成由m个特征峰响应值曲线的迭加而成，按其统计原理可获得中药指纹图谱的总量零阶矩（AUCT）、总量一阶矩（MCRT）及总量二阶矩（VCRT）等一系列总量统计矩参数[26]，由总量统计矩参数可计算得总量统计矩相似度[27]。

中药及其复方指纹图谱上有若干个峰，每1个峰就与相应成分对应，其峰的强度由这个成分的构成比与在一定色谱条件下的响应系数决定（灵敏度），还与色谱柱的分离度相关，因此1个成峰的出现与不出现的自由权是在这一色谱条件的综合反映，因此将各成分看成1个信息，则可用信息熵，通过计算和比较信息熵够反映指纹图谱所携带成分的信息总量的变化，见公式（1）。此外，将信息熵乘以峰面积可获得信息量参数，可表征色谱学上的作用强度[28]。

H为信息熵，Wi为第i个峰的峰面积百分比（出现的概率）

2.2 动物分组与致敏

取昆明种小鼠，随机分为14组，其中1组为正常组（生理盐水组），其余13组为鱼腥草注射剂组，每组6只。按鱼腥草注射剂的正常用量（约LD50～LD70）确定给药剂量为18.1mL/kg(1mL药液相当于生药材2g），鱼腥草注射剂组尾iv药物，正常组尾iv0.9%氯化钠溶液；给药后的13组鱼腥草注射剂组分别于0.15、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、4.00、8.00、10.00、12.00、24.00h摘眼球取血，正常组于给药后0.15h摘眼球取血。

2.3 血液样品处理

将待测血浆1.0mL置于尖底塑料刻度离心管中（含肝素抗凝），加入正己烷1.0mL（含内标正十五烷0.02756mg/mL），涡旋混合2min,2000r/min离心5min，-20℃冷冻保存12h，取出再以2000r/min离心5min。取上清液置-20℃冰箱待测。

2.4 GC-MS分析条件

2.4.1 色谱条件

Rtx-5ms石英毛细管柱（30.0m×0.25mm×0.25μm），升温程序：初温为60℃，以2℃/min升至140℃，保持5min；再以10℃/min升至200℃，保持9min；分流比为15∶1，载气为高纯He(99.999%）；载气体积流量为1.0mL/min；气化室温度为250℃。

2.4.2 质谱条件电子轰击离子源；

离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；电子能量为70eV；接口温度为280℃；溶剂延迟2.5min；扫描范围m/z40～500；进样量为2μL。

2.5 小鼠血清IgE的含量测定

将小鼠血清分离，按照ELISA试剂盒说明书测定血清IgE含量。

3、结果

3.1 不同时间点鱼腥草注射剂在小鼠体内的指纹图谱

各个时间点的鱼腥草注射剂的体内成分指纹图谱见图1。红色箭头表示共有峰，即共有成分，按照保留时间（tR）从小到大分别为共有成分1～10。由于45min之后的峰在空白血浆样品中均有出现，因此只对45min之前的峰进行分析。图中还存在其他的共有峰，通过解谱发现是重复的成分。因此，最后得到的只有图中标注出来的10个共有成分峰。

3.2 鱼腥草注射剂体内成分的划分

根据GC-MS的结果，扣除正常组的峰和空白溶剂峰，共得到鱼腥草注射剂体内代谢产物605个。其中有10个成分在每一时间点中均出现，分别为2,4-二甲基庚烷、3,7-二甲基癸烷、2,6-二甲基癸烷、2,3-二甲基十氢萘、5-甲基十四烷、4,6-二甲基十二烷、4-甲基十二烷、十六烷、正十七烷、2,4-二叔丁基苯酚（表1和图2），按照本课题组前期方法将其余非共有成分归类划分至10个共有成分中[29]。由此，将所有成分划分得到10个成分群（表2),S1～S13为13个时间点所取的血液样本。通过观察发现，成分群1～9主要为脂肪烃，成分群10主要为苯酚，这恰好与10个共有成分相对应。表明该10个成分群在整个鱼腥草注射剂体内成分中极具代表性，浓集并归纳了所有体内成分的特征。

3.3 鱼腥草注射剂体内成分“印迹模板”研究

上述得到的10个成分群组成鱼腥草注射剂体内成分的“印迹模板”，将各个成分群的tR和平均分子连接性指数（molecularconnectivityindex,MCI）列于表3。利用夹角余弦法对10个成分群的MCI进行相似度比较，如表4所示，可以发现各个成分群与总成分群之间的相似度较高（0.980～0.999），表明各个成分群可以较好的代表总成分群的“印迹模板”。各个成分群之间的相似度为0.934～1.000，其中成分群3和成分群6的相似度最低（0.934），成分群4和成分群8的相似度最高（1.000），表明各个成分群之间的“印迹模板”既是相互联系，又是相互独立的，它们共同组成了鱼腥草注射剂体内成分的“印迹模板”。

3.4 体内成分含量与IgE含量的相关性

0.15、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、4.00、8.00、10.00、12.00、24.00h时间点的IgE含量分别为166.1、308.3、300.9、327.5、403.1、185.8、264.0、215.6、290.8、106.0、310.2、301.0、335.7μg/mL，可以发现不同时间点的IgE含量存在波动性，在24h之内的各个时间点与IgE含量没有相关性，最高可以达到403.1μg/mL，最低为106.0μg/mL。运用IBMSPSSStatistics25软件，对体内成分和IgE进行非线性回归，对不同时点的体内成分峰面积和IgE含量做相关性分析，得到每个体内成分的效应系数（表5），得到R2接近于1，表明相关性较好。通过运算得到信息熵，所谓信息熵，其实是信息出现的概率，代表信息的价值，它与热力熵是密切相关的。在这里，它可以代表成分群对于IgE的价值，即成分群的致敏性。进一步计算出每个成分群的信息量（表5），最后对得到的信息量进行排序，也就是体内成分的贡献排序，从大到小依次为成分群3、2、10、4、9、7、6、8、5、1，该结果表示计算得到的鱼腥草注射剂过敏原作用强弱的排序，还需通过实验进行进一步验证。

4、讨论

本课题组前期已经对鱼腥草体外代谢成分进行了研究，得到了一套可用于寻找中药代谢产物“印迹模板”的方法，本研究将该方法进一步用于鱼腥草体内成分，并在此基础上，对所得到的“印迹模板”进行贡献排序，有望对鱼腥草注射剂过敏原的致敏性研究提供思路。

基于超分子“印迹模板”理论，从13批鱼腥草注射剂体内成分中得到10个共有成分，分别为2,4-二甲基庚烷、3,7-二甲基癸烷、2,6-二甲基癸烷、2,3-二甲基十氢萘、5-甲基十四烷、4,6-二甲基十二烷、4-甲基十二烷、十六烷、正十七烷、2,4-二叔丁基苯酚，这些成分在所有体内成分中极具代表性，可能是鱼腥草注射剂过敏原的关键成分。再将其余的非共有成分按照前期的方法进行划分归类，得到10个成分群（印迹模板），每个成分群都有其特定的结构特点，由1个共有成分和若干个非共有成分组成，其中以共有成分作为代表成分。根据相似度计算结果可以得到，这些成分群之间相互联系相互独立，共同组成整体体内成分“印迹模板”。

运用统计软件，将10个成分群与IgE含量进行非线性回归，可以得到每个成分群的效应系数，将效应系数与相应成分群的峰面积相乘并进一步计算得到对应的信息熵，计算出每个成分群的信息熵在10个信息熵总和中的占比，即得到信息量，最后对每个成分群的信息量进行排序，也就是每个成分群所代表的过敏原的致敏性排序，从大到小依次为成分群3、2、10、4、9、7、6、8、5、1。可以得到，成分群3的致敏性最强，其代表成分为2,6-二甲基癸烷，成分群1的致敏性最弱，其代表成分为2,4-二甲基庚烷。其中可以发现，排序靠前的成分群，其结构中大多存在脂肪环和芳香环结构，可以推测其为造成致敏性的关键结构。排序靠后的多为简单的直链烃结构，且成分群1的代表成分结构最为简单。

由于中药注射剂中往往含有多糖、黄酮、皂苷、植物油、挥发油等天然超分子客体，可以通过氢键、范德华力和离子键相互作用等形成超分子。同时，这些成分也是天然免疫佐剂，因此，当注射剂中存在“印迹模板”的“己-己”与“己-类”的直接与间接识别（攻击）而产生（类）致敏反应就不难理解了。由于这种免疫反应与超分子结构特征有关，而超分子结构特征又受制剂工艺、给药途径的影响，其作用还要受到人体潜在“类己”的“印迹模板”拷贝状态影响，具有隐蔽性和随机性，且难发现和研究，这正是制约多成分注射剂，特别是中药注射剂安全性研究的困难之所在，也是临床注射剂安全使用防范的重点。

综上，本研究尝试将先前发现的“印迹模板”确定方法由体外推广到体内，并进一步延伸用于过敏原的研究。然而最终的过敏原的过敏性排序为计算得到，需要通过实验进行进一步验证。

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文章来源：周燕子,陈锋,王敏存,肖美凤,贺福元.基于超分子“印迹模板”的鱼腥草注射剂致敏原研究[J].中草药,2022,53(01):154-161.