摘要:研究发现泛素-蛋白酶体系统具有重要的泛素化与去泛素化功能,参与许多细胞生物学过程。去泛素化酶是真核细胞中泛素-蛋白酶体系统重要组成部分,可以直接或间接影响炎症、凋亡以及增殖等细胞活动,并调控动脉粥样硬化的进程。鉴于去泛素化酶的重要性,本文综述了去泛素化酶在动脉粥样硬化中的作用及其机制,为临床动脉粥样硬化的诊治提供依据。
泛素(Ub)的发现使人们了解到蛋白调控的新系统即泛素-蛋白酶体系统(UPS)[1]。UPS广泛存在于各类细胞,参与信号传导、炎症等多种生物过程。正常的细胞功能高度依赖细胞内蛋白丰度的精确控制,该控制由蛋白质翻译、折叠和降解等进行调节。UPS生物功能的执行主要依赖于两类重要酶的作用。一类是泛素化酶,发挥着泛素化的作用。泛素化过程是依次通过泛素活化酶、泛素结合酶、泛素连接酶使底物蛋白被标记上泛素分子,引发被标记蛋白的降解或生物效应改变。去泛素化过程借助于去泛素化酶(DUB)。去泛素化酶可使已与泛素结合的靶蛋白去泛素化,来阻止靶蛋白的降解或生物效应的改变[2]。研究结果表明去泛素化酶对炎症、凋亡以及增殖等细胞活动均有着至关重要的作用,参与了恶性肿瘤[3]、神经系统退行性疾病[4]等众多疾病的发生发展。
1、参与动脉粥样硬化过程相关去泛素化酶的研究进展
1.1 泛素特异性蛋白酶(USP)
USP是去泛素化酶家族中数量最多的一类,目前对该家族的研究也在日益增多。在肿瘤研究领域首次提出头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)基因的突变或异常可阻断其抑癌作用[5]。最新的研究发现CYLD具有去泛素化酶的活性并与动脉粥样硬化(As)有着密切的联系。多数研究已证明核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)是免疫反应、炎症和血管重构的重要中介,其激活可致As相关CYLD细胞因子与黏附分子基因的协同激活。肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRAF)家族中的一些成员例如TRAF2、TRAF6可对自身进行泛素化,而后通过与细胞内各种分子相互作用最终影响NF-κB通路。抑制性NF-κB激酶(NF-κBinhibitorkinase,IKK)是催化亚基IKKα、IKKβ和调控亚基IKKγ组成的一个复合体。当IKKγ被泛素化后可引起IKK复合体的激活,这一激活过程可使NF-κB抑制蛋白(NF-κBinhibitor,IκB)间接被泛素化修饰,进而引起NF-κB通路的激活[6]。IKKγ在NF-κB途径中起着承接胞外刺激并引导下游分子的重要作用,因此也被称为NF-κB重要调节因子(NF-κBessentialmodulator,NEMO)。泛素与去泛素化修饰是NF-κB通路中非常关键的一个环节。
有报道指出去泛素化酶CYLD通过去除TRAF2、TRAF6、NEMO上的泛素分子负向调控NF-κB通路,最终可缓解As[7]。此外,CYLD对受体相互作用蛋白1(thereceptor-interactingprotein1,RIP1)的去泛素化调控,不仅可以有效地负向调节NF-κB通路,还可以阻断细胞凋亡。白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)作为一种NF-κB驱动基因,其表达与激活可导致NF-κB通路活化。在这一激活过程中,若IL-6受到去泛素化酶CYLD的去泛素化作用,NF-κB所驱动的各种炎症信号则可明显减轻[8]。除了肿瘤坏死因子、白细胞介素等胞外刺激激活NF-κB途径,B淋巴细胞瘤蛋白3(B-cellleukemia-3,Bcl-3)介导的NF-κB信号活化也发挥着重要作用。泛素化的Bcl-3可进入细胞核发挥其激活作用,而这一过程可被CYLD的去泛素化作用所阻断。CYLD抑制NF-κB通路的作用可能是抗As的潜在靶点。当用肿瘤坏死因子刺激内皮细胞后,内皮细胞中的CYLD表达升高。进一步使用siRNA干扰内皮细胞的CYLD表达后,同样的刺激下细胞内IL-6的表达上升,且单核细胞对内皮细胞黏附力增强[9]。以上结果表明,CYLD可减少血管系统的炎症损伤,而CYLD功能丧失则可加重炎症反应[7]。
一般认为巨噬细胞向泡沫细胞的转变是As过程的初始和核心步骤[10]。相关研究表明,在给予氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)处理后,已经敲除CYLD基因的巨噬细胞内IL-1β、TNF-α和MCP-1等炎症细胞因子和黏附分子基因表达增加。siRNA介导的CYLD沉默导致巨噬细胞清道夫受体A(scavengerreceptor-A,SR-A)、CD36的增加和清道夫受体B类Ⅰ型(scavengerreceptorclassBtypeⅠ,SR-BⅠ)降低,从而促进巨噬细胞转变成泡沫细胞[11]。以上结果表明,脂质代谢相关基因的综合作用是使巨噬细胞在丧失CYLD时,促进脂质积累,而脂质的积累又进一步促进了As的发生。综上,巨噬细胞中CYLD的表达起着抑制As进展的作用。
此外,最近有报道称CYLD可通过去泛素化Bcl-3抑制cyclinD1和E2F通路,最终抑制细胞增殖。Bcl-3在胞核和胞质中均有表达,但在转染CYLD的平滑肌细胞中Bcl-3主要存在于细胞质中。重要的是,催化无活性的CYLD过表达使Bcl-3主要位于细胞核内。过表达CYLD显著降低cyclinD1的表达,但Bcl-3蛋白的表达没有显著变化,而催化无活性CYLD后cyclinD1的表达没有显著变化。以上报道表明,CYLD通过去泛素化Bcl-3阻断cyclinD1和E2F通路,抑制平滑肌细胞增殖。既往研究指出血管平滑肌细胞过度增殖是促进As发展的基础之一,最近发现的CYLD抑制平滑肌细胞增殖,对As起着负调控的作用。以上研究为CYLD参与As提供了明确的证据。
除了上述所介绍的USP家族中CYLD对As的调控作用,该家族的其他成员也可通过不同的途径影响着As。例如,在巨噬细胞中去泛素化酶USP7、USP47、USP50可激活NLRP3炎性小体,促进IL-1β、IL-18等促炎细胞因子释放[12,13],从而增加斑块的不稳定性。Toll样受体4的激活触发了β-arrestin2和TRAF6的泛素化,从而增强NF-κB信号通路。平滑肌细胞中的USP20可以去除β-arrestin2上的泛素分子,进而使USP20结合到TRAF6上形成复合物,从而抑制NF-κB[14]。另外,受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interactingproteinkinase1,RIPK1)被USP20去泛素化后,下游信号通路减弱,明显减轻As[15]。USP12介导的IκBα磷酸化激活了巨噬细胞内NF-κB信号,进而促进As的发生发展[16]。在脂多糖刺激下,USP25能抑制炎症因子TNF-α、IL-6和干扰素β的释放,并降低IκBα降解,最终抑制NF-κB信号[17]。敲除USP2或USP14可加速巨噬细胞中TNF-α的蛋白降解,这意味着这两种去泛素化酶可能对As起着促进作用[18]。敲除USP39抑制血管重构模型中血管平滑肌细胞的增殖,间接说明USP39促进As[19]。
1.2 泛素羧基端水解酶(UCH)
目前对该家族成员的了解有限,所鉴定出的成员限于乳腺癌1号基因相关蛋白(BAP1)、泛素C端水解酶异构体L1(UCHL1)、泛素C端水解酶异构体L3(UCHL3)和泛素C端水解酶异构体L5(UCHL5)。该家族成员中UCHL1在As方面的研究相对较多。
UCHL1兼具了水解酶和连接酶活性,在泛素化-去泛素化过程中发挥着关键作用。在TNF-α诱导的大鼠平滑肌细胞迁移过程中,UCHL1的表达随着TNF-α诱导时间的延长而增加,但平滑肌细胞的迁移能力和细胞内IκB蛋白水平却是下降的。这些结果表明UCHL1可能通过作用于IκB抑制TNF-α诱导的NF-κB通路。具体来说,UCHL1可以通过去泛素化作用增加IκB的表达,最终抑制NF-κB通路活性。相反,siRNA敲除UCHL1导致平滑肌细胞中NF-κB活性增强。在UCHL1过表达时,单核细胞对内皮细胞的黏附力减弱,表明UCHL1可间接抑制As。另外,高表达的UCHL1可抑制新生内膜形成,具有抗增殖作用,这与既往研究发现肿瘤生长刺激UCHL1表达是一致的。UCHL1影响泡沫细胞形成,进而调控As的进程,然而这种作用却与CYLD完全相反。UCHL1抑制剂或siRNA介导的UCHL1沉默均可下调CD36蛋白的表达,但是SR-A、ATP结合盒转运体A1(ATP-bindingcassettetransporterA1,ABCA1)和SR-BⅠ却没有显著变化[20]。由此可知,UCHL1调控CD36的表达,促进巨噬细胞源性泡沫细胞形成,进而促进As的进展。
综上所述,UCHL1对细胞增殖、迁移和NF-κB通路的抑制,使其具有抗As的效应。但是,该分子通过促进CD36蛋白引起泡沫细胞的生成进而促进As。UCHL1这种通过不同的机制对As病理过程起着相异的作用,因此UCHL1对As的确切作用和相关机制仍有待深入研究。
1.3 卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)
该家族成员因与卵巢癌基因具有同源性,所以被鉴定为卵巢肿瘤蛋白酶家族。该家族分成员大概可分为OTUB、OTUD、拟A20型、OTULIN亚家族。
A20是卵巢肿瘤蛋白酶中拟A20型亚家族中的一个关键成员,因其表达可受到肿瘤坏死因子的刺激,所以也被称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(TNF-α-inducedprotein3,TNFAIP3)[21]。与对照组小鼠相比,A20/TNFAIP3基因敲除小鼠的炎症反应较强,且RIP、TRAF6的泛素化水平升高,这些均导致NF-κB信号增强。另有报道指出,在低剪切应力环境下,A20/TNFAIP3抑制内皮细胞内IκB降解,负调节NF-κB信号[22],阻碍单核细胞向内皮细胞滚动,并防止与As发展有关的促炎状态发生。A20/TNFAIP3也可以去泛素化被IκB激酶磷酸化诱导的IκB泛素化,导致NF-κB通路的反馈抑制。A20/TNFAIP3可抑制巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活及其相关炎症反应,从而稳定As斑块[23]。
除了对炎症反应的调节,A20/TNFAIP3在细胞增殖方面也发挥着重要作用。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21waf1和p27kip1同样也受到了UPS的调控,A20/TNFAIP3对二者的去泛素化抑制了平滑肌细胞增殖。内皮细胞特异性A20/TNFAIP3敲除小鼠血管内皮钙黏蛋白表达降低,内皮屏障受损[24]。
在As晚期病变中,A20/TNFAIP3起着重要的抗凋亡作用。A20/TNFAIP3通过阻断Fas/FasL诱发的Caspase-8信号和线粒体通路,对抗TNF-α或TLR4诱发的细胞凋亡,最终在巨噬细胞中表现出抗凋亡作用,延缓As的进展[25]。CD36是促进ox-LDL摄取的清道夫受体家族。在肝细胞特异性A20/TNFAIP3敲除小鼠中,CD36高表达,导致脂肪酸和胆固醇的摄取和合成增加。CD40/CD40L是As进展中的重要中介,而A20/TNFAIP3可保护内皮细胞免受CD40/CD40L介导的凋亡。TRAF6可通过泛素化Beclin-1增强TLR4诱导的巨噬细胞自噬,进而稳定晚期As斑块,这一过程可以被A20/TNFAIP3所逆转。
内皮细胞表型的转变及As的空间定位与局部血流动力学密切相关。血管一般在靠近分支和弯曲处暴露于复杂的血液流动模式,并产生沿血流方向变化的低剪切力,这种低剪切力促进内皮细胞过度增殖,并易产生炎症反应[26,27]。低氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)是典型的缺氧激活因子,并对As的进展起着促进作用。最新研究发现,在机械低剪切应力环境下,去泛素化酶Cezanne可以通过去泛素化作用去除VHL上的泛素分子,进而稳定HIF-1α[28],增强炎症反应并诱导内皮细胞过度增殖,最终推动血管分支和弯曲部位As的起始。
1.4 MINDY蛋白酶家族
此家族是去泛素化酶中发现较晚的一个家族。目前对其成员的鉴定也只有4个,分别命名为MINDY1、MINDY2、MINDY3和MINDY4。
1.5 马查多-约瑟夫病蛋白结构域蛋白质酶(MJD)
最初的研究表明,该家族成员在神经系统疾病方面起着调节作用。随着研究的深入,在肿瘤方面也发现其有着重要的作用,例如Ataxin-3在非小细胞肺癌中可以抑制PTEN的转录。但此家族在As领域中的研究尚未有相关报道。
1.6 JAMM/MPN区域相关金属肽酶
近年来对此类去泛素化酶的研究在逐年增加,发现并鉴定了越来越多的该家族成员,如POH1、CSN5、BRCC36、AMSH、AMSH-LP等。CSN(COP9signalosome)是一个八亚基(CSN1-CSN8)蛋白复合物,是JAMM/MPN区域相关金属肽酶家族中的一员。众所周知,细胞内胆固醇稳态的破坏可导致包括心血管疾病在内多种病理状况,ABCA1是维持胆固醇稳态的关键因素[29]。高密度脂蛋白的形成是唯一已知的清除外周细胞中多余胆固醇的途径,这一形成过程离不开ABCA1介导的脂质流出[30]。ABCA1功能障碍可导致丹吉尔病,患者缺乏循环高密度脂蛋白,组织巨噬细胞中明显的胆固醇酯积聚,导致泡沫细胞大量形成并浸润血管壁,进而促进As的进展[31]。抑制ABCA1降解是通过打破胆固醇积累、凋亡和炎症反应之间的恶性循环,从细胞中输出游离胆固醇,从而抑制斑块形成的一种途径。ABCA1的降解受到精密的调控,并通过多种途径进行。
最新研究指出,ABCA1可通过泛素-蛋白酶体途径进行降解[32]。相关实验表明,当表达ABCA1的人胚胎肾细胞用蛋白酶体抑制剂MG132处理时,泛素化形式的ABCA1增加了数倍。然而,当与CSN共表达时,泛素化形式的ABCA1在MG132存在时没有增加,并保持在MG132处理前的基础水平。以上结果表明,CSN复合物是控制ABCA1泛素化和去泛素化的关键因素,通过与CSN复合物的结合降低了泛素化ABCA1,从而减少ABCA1的降解[33]。CSN功能障碍会导致ABCA1含量降低,脂质流出受到明显限制从而促进As的进程。CSN亚基CSN5可负调控NF-κB依赖的炎症过程和单核-内皮细胞的黏附[34]。上述研究均为CSN作为潜在预防As重要靶点提供有力的证据。
去泛素化酶POH1可抑制巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活[35],从而稳定斑块,相反,BRCC3可促进NLRP3引起的炎症反应[36],增加斑块不稳定性。单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1(monocytechemotacticprotein-1-inducedprotein-1,MCPIP1)最近被鉴定为含锌指蛋白,凭借着去除TRAF蛋白上的泛素分子可阻断NF-κB活化,负调控巨噬细胞炎症反应[37]。此外,MCPIP1可抑制应激颗粒的形成,并使巨噬细胞在应激条件下凋亡。MCPIP1诱导的巨噬细胞凋亡是解决巨噬细胞炎症的新途径,同样也为阻止As的发展提供了新思路。
2、去泛素化酶的检测与调控
目前,去泛素化酶活性检测方法大多是将Ub与荧光标签连接。当去泛素化酶水解Ub后,荧光标签游离出来,此时读取荧光值就可以测定去泛素化酶活性的强弱。例如,第一个被发现广泛应用于多种去泛素化酶活性检测的荧光标签是7-氨基-4-甲基香豆素。随着检测技术的改进,如罗丹明-110、四甲基罗丹明、Nanoluc等荧光标签亦被用于检测去泛素化酶活性[38]38]。除此之外,荧光共振能量转移、光笼细胞渗透性泛素探针等也成为了研究去泛素化酶活性非常有用的工具[39]39]。然而,各类去泛素化酶又具有其各自的特异性,这使检测特定的去泛素化酶较为困难。最新研究通过在Ub保守的C端引入非天然氨基酸,设计合成基于Ub的去泛素化酶选择性化学工具[40]40]。利用这种方法,对识别Ub的蛋白酶都可以设计一个高度活跃和选择性的非自然底物或活性探针。
目前可调控去泛素化酶的化合物数量较少,可批准的药物则更少。研究发现PR-619是吡啶类广谱去泛素化酶抑制剂,但因缺乏特异性导致其应用受到了极大的限制[41]41]。去泛素化酶不可逆抑制剂泛素醛(Ubal)和泛素乙烯砜(UbVS),同样缺乏特异性。小分子IU1对USP14具有高度选择的抑制活性。研究揭示IU1选择性抑制去泛素化酶USP14,其机制是通过空间阻滞的别构调节[42]42]。USP7的调节剂近年来研究较多,包括非特异性抑制剂如P5091、HBX-41108、HBX-19818[43]43]到现在更具研究潜力的XL188、ALM5、FT671[44]44]。新开发研究出来的含有N-氰基吡咯烷的小分子可作为靶向UCHL1,催化半胱氨酸的共价抑制剂,作为工具药应用于多种疾病的研究。此外,一些靛红O-acyl肟系列的化合物也可抑制UCHL1。有文献报道了一种双USP25/USP28抑制剂AZ1,其对USP25抑制作用更强[45]45]。USP2已被证实在肿瘤、As进展中起着关键作用,是治疗的靶点。6-硫鸟嘌呤对USP2表现出非竞争性和缓慢结合性抑制作用[46]46]。体外高通量筛选鉴定了一种名为Subquinocin的小分子,证实其可作为CYLD抑制剂。
3、小结
综上所述,去泛素化酶是参与蛋白质调节的重要机制,通过调节炎症分子、信号通路、细胞增殖等多个方面来参与As的进程(图1)。未来,通过探讨去泛素化酶的生理和病理生理作用,可为临床治疗相关疾病提供一些新策略,尤其为As的干预诊治提供新思路。
参考文献:
[27]瞿凯,邱菊辉,王贵学.血管内皮细胞屏障功能的血流动力学调控及其与动脉粥样硬化的关系[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(1):1-6.
文章来源:周孟学,王中群.去泛素化酶在动脉粥样硬化中的研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2022,30(02):161-166.
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卒中是中国成人致死、致残的首位病因,其中脑梗死约占全部脑卒中的65%。大动脉粥样硬化性脑梗死是脑梗死中最常见的类型,而颈动脉粥样硬化是全身动脉硬化的代表部位。尽管有一些有效的预防颈动脉粥样硬化的方法,但控制或逆转其早期进展为动脉粥样硬化的意义重大。
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2024-04-22动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病[1],血管钙化在AS中普遍存在,Runt相关转录因子2(Runt transcription factor 2,RUNX-2)是经典钙化分子[2,3]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)在AS和钙化纤维帽中可见表达。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)是一种肠道细胞分泌的促胰岛素分泌激素,其受体激动剂可减轻体重、保护胰岛β细胞和保护
2024-04-15动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病的重要病理基础,也是导致全球死亡率居高不下的主因,而巨噬细胞在AS发展中的作用机制日益受到关注。AS是一种慢性炎症性疾病,涉及血管内皮细胞损伤、免疫细胞聚集、平滑肌细胞异常增殖和脂质沉积等。虽然降脂药物能够有效控制血脂并减缓AS的进展,但许多患者仍面临急性心血管事件的风险,这提示仅控制血脂水平不足以有效改善AS。
2024-04-15脑血管病现位居我国国民死亡原因首位,颈动脉不稳定斑块与缺血性脑血管病密切相关。血管内皮损伤、脂质沉淀是血管病变的重要原因[1,2],并且与极低密度脂蛋白(V-LDL)有一定的关系[3,4],脂质的堆积、血小板聚集、吞噬细胞的附着、炎性因子的分泌使其形成了不稳定的斑块;不稳定斑块糜烂,伴破裂形成血栓,最终导致缺血性脑卒中。
2024-03-29动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是影响全世界人民的最大健康问题之一[1]。现代医学认为[2],炎症反应对动脉粥样硬化的形成发挥关键作用。自噬是维持细胞和机体能量平衡的代谢过程,主要是通过吞噬包被进入囊泡,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解内容物,以实现细胞本身代谢需要及更新[3]。研究表明,自噬与心血管疾病密切相关,尤其是AS的发生发展[4]。
2024-03-15动脉粥样硬化是一种常见的大动脉疾病,是动脉管壁的一种长期的慢性炎症性疾病,也是动脉硬化的主要原因,是导致动脉壁增厚和失去弹性的疾病[1]。随着世界人口中年龄因素以及越来越多的肥胖患者和糖尿病患者的出现,AS及其并发症(冠心病)每年导致的人类死亡人数高居不下,严重危害人类健康[2,3]。因此探寻有效的干预药物对于防治动脉粥样硬化相关疾病具有重要意义。
2024-03-07动脉粥样硬化是典型的脑血管疾病,是急性脑梗死的基本病理基础,积极控制患者血脂水平,对减少心脑血管事件带来的风险具有重要意义[2]。阿托伐他汀钙是临床上应用最广泛、疗效最确切的他汀类调脂药物,可通过干预肝细胞内胆固醇的生成过程发挥降脂作用,同时具有减轻炎症反应及氧化应激的作用,是指南推荐的脑梗死预防一线用药[3,4]。
2024-02-28脑卒中在世界范围内的致残率和致死率很高,颅内外动脉粥样硬化所致动脉管腔狭窄和闭塞是缺血性脑卒中重要的危险因素[1,2]。并且该类患者入院时临床症状更严重,5年的复发率和死亡风险均较高。因此,对于该类患者进行及时有效地治疗尤为重要。对于高危患者的早期识别,可以提供更深入的指导和管理,从而更好地应对相关问题。
2024-02-20动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是导致心血管疾病的主要病理生理基础,其发病机制有多种学说,包括脂质浸润学说、慢性炎症学说等[1],其特征是动脉壁内膜发生明显的慢性炎症反应,而单核巨噬细胞系统参与了炎症反应的过程,在AS的进程中发挥了重要作用[2]。达格列净作为钠-葡萄糖协同转运体2(sodium glucose co-transporters 2,SGLT2)抑制剂,是用于治疗糖尿病相对新的一类抗高血糖药物。
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期刊名称:临床心血管病杂志
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主办单位:华中科技大学心血管病研究所,华中科技大学协和医院
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专业分类:医学
国际刊号:1001-143
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