冠心病是冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病，属中医学的“胸痹”范畴。该病严重危害着人们的生命健康，2018年我国冠心病患者已达1100万，近年来该病的发病率愈加呈上升、年轻化的趋势[1]。中医药在冠心病防治中有着独到的优势，因此深入挖掘中医药在冠心病中的用药规律有着重要意义。

中医药学强调事物本身的统一性、完整性和联系性，强调整体观念，而网络药理学是从整体上探索药物与疾病的相关性，其整体性、系统性和注重药物与靶点间相互作用的特点与中医药学的基本观念相吻合，是一门从系统层面揭示中药对机体网络调控作用的新兴学科。网络药理学利用大数据和计算机可视化分析预测药物分子的作用靶点、信号通路和作用机制，为新药研发节约了成本，可在一定程度上解决传统中药研究中过于单一的问题。本文通过数据挖掘和网络药理学技术研究冠心病的用药规律，旨在进一步揭示中药治疗冠心病的分子机制。

1、资料与方法

1.1 病案收集

本文数据来源于中国知网、万方数据及维普中文科技期刊全文数据库，采用“冠心病验案or冠心病举隅or胸痹验案or胸痹举隅”检索式检索2010年1月至2020年2月的所有期刊文献，共检索出610篇，筛选并剔除重复文献，共纳入222篇，共计343个病案。

1.2 纳入标准

1)符合《内科学》[2]中冠心病的西医诊断标准，以及《中医内科学》[3]中胸痹的诊断标准，并且证型、方药完整的中医诊治文献；2)使用中药内服法治疗。

1.3 排除标准

1)学术思想探讨与综述类文献；2)单味药、药对及复诊处方。

1.4 数据处理

运用Excel2019收集每个病案的证型和用药，构建冠心病用药数据库，采用双人分别录入模式，录入完成后进行双人交叉核对，若存在不一致处则协商解决，以确保数据的准确性和规范性。参照《中药学》[4]以及《证素辨证学》[5]对其中涉及到的证型和药物的名称进行规范化处理，并将证型中包含的病性证素提取出来，例如：“炙甘草→甘草”“山萸肉→山茱萸”“气虚血瘀→气虚+血瘀”等。

1.5 数据挖掘

运用Excel2019分别对证素和用药进行频数统计，按降序处理并计算相应的频率。提取频率≥10%的所有中药以及频次≥10次的证素组合。在PyCharmCommunityEdition2020.1.1中运行Python3.8.3,对所有高频证素组合的高频用药进行排列组合，设置最小组合数为2,最大组合数为6,其中包含有证素与中药的组合，也包含没有证素只有中药的组合，筛选出含有证素组合和中药的所有组合进行频数分析，筛选出频率≥7%的“证素-中药”组合，并计算各组合的权值。根据朱文锋教授的双层频权剪叉算法[6]确定计算方式为：某一“证素-中药”组合的频数/出现该证候或使用该中药组合的所有“证素-中药”组合的频数。例如，“气虚+血瘀，丹参，黄芪”这一“证素-中药”组合的权值=“气虚+血瘀，丹参，黄芪”这一“证素-中药”组合的频次/所有包含“丹参，黄芪”这一证候组合的“证素-中药”组合的频次。权值越大说明特异性越强。筛选出所有权值≥0.8的组合，再将筛选的结果取并集，得出每一证素组合的高频用药，最后再对各证素的高频用药取并集，得出高频药对“丹参-郁金”。

1.6 中药活性成分及其靶基因筛选

在中药系统药理学数据库平台[7]输入丹参、郁金2味中药名称，并对查找到的有效成分依据口服生物利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥0.18进行筛选。然后通过TCMSP平台确定收集到的有效成分的蛋白质靶点。筛选结束后通过Uniprot数据库[8]对药物有效成分对应的蛋白质靶点规范为基因靶点。

1.7 疾病靶基因筛选

以“coronaryheartdisease”“coronaryarterydisease”等与冠心病相关的疾病为关键词，挖掘Genecards数据库[9]、OMIM数据库[10](http://www.omim.org)、TTD数据库[11]中治疗冠心病的潜在靶点，进入DRUGBANK数据库[12](https://www.drugbank.ca),寻找治疗冠心病的临床一线西药作用靶点予以补充。在Genecards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病联系密切，对所有Score取中位数，将Score≥3.91的目标靶点作为冠心病的潜在靶点，合并4个疾病数据库靶点后，删除重复值得到冠心病基因靶点。

1.8 蛋白互作网络图的构建与潜在蛋白质功能模块分析

将筛选出的中药靶基因与冠心病疾病靶基因取交集，并通过DrawVenndiagrams网站绘制韦恩图。然后将交集靶点提交至STRING数据库[13](https://string-db.org)构建蛋白互作(PPI)网络图，将生物种类设定为“Homosapiens”,最小相互作用阈值设定为“highestconfidence>0.9”,其余设置均为默认设置，得到PPI网络，导入CytoScape软件[14](v3.9.0)中输出目标PPI网络图，并运用Cytoscape中的MCODE插件(默认设置)对PPI网络进一步分析，得到潜在蛋白质功能模块[15]。

1.9 GO与KEGG富集分析

将“中药-疾病”交集靶基因上传至DAVID平台[16](https://david.ncifcrf.gov/)进行GO与KEGG富集分析。GO富集分析包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)分析。将结果按靶基因的P值进行降序排序，选取排名前15位的结果，在RStdio1.3.1073下运行R4.0.2对数据进行可视化展示。将KEGG富集分析结构导入Cytoscape3.9.0绘制通路基因网络图，根据每条通路所对应的基因数和每个基因所对应的通路数排序，数量越大的节点颜色越深。

2、结果

2.1 频次统计

本研究录入的343个冠心病医案处方中，涉及94种证素组合，累计频次288次，频次≥10次的组合有6个(共计127次),排名前3位的组合为“气虚+血瘀”“气滞+血瘀”“痰+血瘀”;涉及313味中药，累计频次4852次，使用频率≥10%的中药共37味，排名前10位的中药为丹参、甘草、川芎、半夏、茯苓、当归、黄芪、薤白、赤芍、瓜蒌。

2.2 证素中药筛选

对包含高频证素的127个病案进行排列组合后，筛选出频率≥7%的组合，“证素-中药”组合共计245个。对所有组合进行权值计算，其中权值≥0.8的“证素-中药”组合有153个，取交集后得到5个“证素-中药”组合，其中中药药味≥5味的有3个，“气虚+血瘀”组为补阳还五汤合八珍汤加减，“痰+血瘀”组为温胆汤合瓜蒌薤白白酒汤加减，“气滞+血瘀”组为柴胡疏肝散合桃红四物汤加减(见表1)。通过观察能发现，除去方剂中的药味后，这3个组合中都用到了丹参和郁金。

2.3 中药活性成分及其靶基因筛选

通过TCMSP和Uniprot数据库筛选出活性成分80个，其中丹参65个，郁金15个。筛选出靶基因共984个，其中丹参906个，郁金78个，去除重复值后共计148个靶基因，20个核心化合物，核心化合物包括柚皮素(naringenin)、隐丹参酮(cryptotanshinone)、黄芩苷(Baicalin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)等。(见表2)

2.4 疾病靶基因筛选

从Genecards数据库获得冠心病靶点7100个。取Score≥3.91的靶点为冠心病的潜在靶点，共计3552个。结合OMIM、TTD、DRUGBANK数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到4027个冠心病相关靶点。

2.5 蛋白互作网络图构建与潜在蛋白质功能模块分析

将148个中药靶点与4027个疾病靶点取交集，得到120个交集基因靶点(见图1)。将120个交集基因提交至STRING平台，得出PPI网络图，导入到Cytoscape3.9.0中，筛选连接度(Degree)≥10的基因，并修改节点颜色参数，使节点随着连接度的不断增大而颜色不断加深(见图2),连接度排名前10位的基因为STAT3、AKT1、TP53、JUN(c-Jun)、MAPK3、MAPK1、APP、TNF、RELA(NF-κBp65)、MAPK14。随后，通过MCODE分析，按相关性由高到低得到3个潜在蛋白质功能模块(A、B、C)(见图3)。A功能模块基因主要与cGMP-PKG和cAMP信号通路相关；B功能模块基因主要与HIF-1、FoxO、p53、PI3K-Akt、MAPK、NF-κB等信号通路相关；C功能模块基因主要与炎症反应、氧化应激、凋亡等生物进程相关。

2.6 GO与KEGG富集分析

将120个交集靶基因提交至DAVID平台，导出GO与KEGG富集分析结果，根据P值降序排序，取排名前15位的结果进行可视化展示，-Logp为P值对数的相反数(见图4～6)。

GO富集分析共得到717个结果，其中BP566个，CC71个，MF80个。BP主要与RNA聚合酶II启动子的转录正调控(positiveregulationoftranscriptionfromRNApolymeraseIIpromoter)、凋亡过程的负调控(negativeregulationofapoptoticprocess)、细胞增殖的正向调节(positiveregulationofcellproliferation)等相关。CC主要与胞质(cytosol)、细胞质(cytoplasm)、核(nucleus)等相关。MF主要与蛋白结合(proteinbinding)、相同的蛋白结合(identicalproteinbinding)、酶结合(enzymebinding)等相关。

KEGG富集分析共得到108个结果，其中与冠心病相关的通路主要是PI3K/Akt信号通路(PI3K/Aktsignalingpathway)、HIF-1信号通路(HIF-1signalingpathway)、FoxO信号通路(FoxOsignalingpathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNFsignalingpathway)、细胞凋亡(Apoptosis)。(见图7)

3、讨论

冠心病属于中医学“胸痹”的范畴。中医学认为胸痹的发生多与寒邪内侵、饮食失调、情志失节、劳倦内伤、年迈体虚等因素有关。冠心病中医证候多属本虚标实、虚实夹杂的复合证型，本虚以气虚为主，标实以血瘀、痰浊为主，同时可兼见阴虚、气滞、阳虚等证候要素；其中气虚、血瘀、痰浊之间关联度最强；证候类型以气虚血瘀、气虚痰瘀、气阴两虚血瘀、痰瘀互结最为多见[17]。通过对343个冠心病中医病案进行数据挖掘发现，气虚血瘀证的常用药为丹参、黄芪、甘草、川芎、赤芍、桃仁、当归、党参、三七、葛根、红花、延胡索、茯苓、郁金、桂枝，可归纳为补阳还五汤合八珍汤加减；气滞血瘀证的常用药为川芎、枳壳、柴胡、赤芍、甘草、红花、当归、桃仁、丹参、葛根、郁金，可归纳为柴胡疏肝散合桃红四物汤加减；痰瘀互结证的常用药为丹参、半夏、瓜蒌、薤白、茯苓、郁金、甘草、陈皮、枳壳，可归纳为温胆汤合瓜蒌薤白白酒汤加减。除去方剂中包含的药味后，对3个证型剩余药味取交集得出“丹参-郁金”药物组合。

丹参、郁金均为活血化瘀药。丹参的功效为活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈，而郁金的功效是活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄，二药均能治疗胸痹心痛。通过药物活性成分筛选得出，“丹参-郁金”的活性成分主要有柚皮素、隐丹参酮、黄芩苷、β-谷甾醇、木犀草素等。现代药理学研究表明，柚皮素可以通过上调SOD水平，下调MDA水平，激活细胞膜和线粒体膜的ATP敏感性钾通道(KATP),对缺血性心肌起保护作用；还可以下调cleaved-Caspase3,升高Bcl-2/Bax比值，抗心肌细胞凋亡[18,19]。隐丹参酮可以促进内皮细胞中cGMP与NO的合成，形成NO/cGMP通路的扩张，为体内缺血区域补充血液；可以舒张冠状动脉，抑制血管平滑肌细胞Ca2+内流，从而改善血液流变学；可以抑制TNF-α诱导的黏附分子表达，减轻心肌缺血再灌注损伤[20,21]。

黄芩苷能通过下调NF-κB抑制炎症反应，延缓动脉粥样硬化的进程；通过激活p38MAPK信号通路可以诱导动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞凋亡，从而改善冠心病的预后；可以减小线粒体的肿胀程度，减少线粒体损伤，对心肌缺血/再灌注损伤起保护作用[22,23,24,25]。β-谷甾醇可以通过上调SOD水平、下调ROS和MDA水平，缓解氧化应激损伤；下调IL-1β、IL-6和TNF-α水平，改善炎症反应；下调ERK1/2,上调Bcl-2/Bax,抑制心肌细胞凋亡[26]。木犀草素可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症，从而保护心肌内皮细胞；可以清除ROS,从而减轻氧化应激反应，延缓动脉粥样硬化进程；可以激活PI3K/Akt信号通路，从而抑制内质网应激诱导的细胞凋亡、线粒体功能、氧化应激等途径改善心肌缺血再灌注损伤[27]。

通过PPI网络聚类分析与KEGG富集分析发现，“丹参-郁金”主要通过调控PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、TNF、NF-κB和MAPK等信号通路对冠心病发挥治疗作用。在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中，PI3K/Akt的激活可以调控NF-κB的作用，抑制IL-1β、TNF-α等炎症因子的过表达，减轻心肌细胞的损伤；PI3K/Akt的激活也可以调控FoxO1与FoxO3的作用，从而抑制下游细胞凋亡基因的表达[28]。HIF-1能能通过促进产生抗氧化因子保护MIRI,另一方面能通过调节Bcl-2抗凋亡家族成员如Mcl-1、VEGF等多个抗凋亡因子的表达发挥抗凋亡作用[29]。p38MAPK的活化可以激活下游NF-κB的活化，导致TNF-α的合成与释放，继而与相应的受体结合诱发凋亡。高糖可使p53基因糖基化而激活，进而导致血管紧张素Ⅱ合成增加，血管紧张素Ⅱ通过p38MAPK途径使p53蛋白磷酸化，最终导致心肌细胞凋亡[30]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是MAPK家族重要成员之一，MIRI能使JNK通路激活引起心肌细胞凋亡，并且与NF-κB通路也有联系[31]。

通过GO富集分析可以预测，“丹参-郁金”治疗冠心病可能与调控核转录、细胞凋亡、细胞增殖、蛋白质磷酸化、一氧化氮合成和细胞缺氧等生物过程有关；可能在细胞质、细胞核、膜、线粒体等细胞组分发挥作用；可能与影响蛋白结合、酶结合、蛋白同源二聚化、转录因子结合、蛋白异源二聚化、细胞因子活性以及DNA结合等分子功能有关。

本研究通过对343个冠心病中医病案用药规律的挖掘，发现了“丹参-郁金”这一治疗冠心病的常用药对，并对其进行网络药理学分析。结果显示，该药发挥作用的主要通路为PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、TNF、NF-κB和MAPK等，主要参与调控炎症反应、细胞凋亡、细胞增殖、氧化应激等病理过程。丹参和郁金均为常用的活血化瘀药，均能治疗胸痹心痛，二药合用对冠心病的治疗能起到协同作用，希望本研究结果对今后的新药研发提供参考。

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文章来源：陈善达,万彩云,李亮.基于数据挖掘和网络药理学的冠心病中医用药研究[J].湖南中医杂志,2022,38(01):21-28.